Том 59, № 1 (2025)

Пандемия COVID-19 стала катализатором развития новых направлений в разработке вакцин, среди которых особо следует отметить технологии на основе нуклеиновых кислот (ДНК и мРНК). К интенсивно развивающейся и перспективной платформе относятся ДНК-вакцины благодаря их высокой стабильности при температуре окружающей среды и способности активировать как гуморальное, так и клеточное звено иммунитета. Полный цикл создания ДНК-вакцины, который включает конструирование плазмидной ДНК, получение штамма-продуцента, ферментацию и очистку, занимает 2‒4 недели. Кроме того, технология производства таких вакцин не требует работы с опасными патогенами, что значительно облегчает процесс их создания и снижает общую стоимость. За более чем 30-летнюю историю стремительного развития технология ДНК-вакцин продолжает претерпевать изменения. В настоящее время имеется лицензированная ДНК-вакцина для профилактики COVID-19, а множество кандидатных профилактических вакцин против вирусных и бактериальных заболеваний находится на стадии клинических испытаний. В обзоре освещены не только принципы конструирования плазмидных ДНК-вакцин, но и новые технологии получения ДНК-конструкций, такие как миникольцевая ДНК, MIDGE ДНК и Doggybone^TM ДНК. Новые типы ДНК-вакцин интересны тем, что они состоят только из самых необходимых элементов для активации иммунного ответа. В таких конструкциях полностью отсутствуют последовательности, необходимые для наработки плазмидной ДНК в бактериальных клетках — например, ген устойчивости к антибиотику. Одна из ключевых проблем в разработке ДНК-вакцины — способ ее доставки в клетки-мишени. На данный момент используют разные методы доставки — как химические, так и физические, — которые бурно развиваются и уже зарекомендовали себя как надежные и эффективные. Характеристики некоторых наиболее перспективных способов также представлены в обзоре.

В представленном обзоре рассмотрены вторичные метаболиты морских грибов-микромицетов, обладающие антибактериальной активностью, как элемент современной стратегии по поиску новых антибиотиков. Более половины применяемых в настоящее время антимикробных препаратов выделены из бактерий (Bacteria) и актиномицетов (Actinomycetes), однако первые антибиотики были выделены из мицелиальных грибов (Ascomycetes) и очевидно, что потенциал аскомицетов еще не исчерпан. Морские грибы занимают отдельную нишу в связи с особенностями их местообитаний, что сказывается и на продукции ими низкомолекулярных соединений. В обзоре приведены сведения о вторичных метаболитах морских грибов, действующих на те бактериальные мишени, на которые нацелен поиск новых антибиотиков, обсуждается стратегия исследования антибактериальной активности метаболитов морских грибов.

Болезнь Паркинсона (БП) — одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которое характеризуется прогрессирующими двигательными нарушениями, обусловленными гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) головного мозга. БП поражает более 1% населения в возрасте старше 60 лет во всем мире. Несмотря на значительный прогресс в понимании патогенеза БП, включая генетические и биохимические аспекты, современная терапия ограничивается симптоматическим лечением. Предполагается, что именно нарушение процессов аутофагии может приводить к накоплению аномальных белков, в частности α-синуклеина, агрегированные формы которого нейротоксичны в отношении дофаминергических нейронов ЧС. Стоит отметить, что БП в основном носит спорадический характер, хотя описаны и моногенные формы заболевания. К наиболее распространенным формам с известной этиологией относят БП, ассоциированную с мутациями в гене GBA1 или LRRK2. Обогащенная лейциновыми повторами киназа-2 (LRRK2), кодируемая геном LRRK2, и лизосомный фермент глюкоцереброзидаза (GCase), кодируемый геном GBA1, вовлечены в один и тот же эндолизосомный путь. Дисфункция LRRK2 и GCase, наблюдаемая при БП, особенно в случае мутаций в генах, кодирующих эти белки, может приводить к нарушению эндолизосомного пути, лизосомной функции и, возможно, аутофагии. В обзоре освещены молекулярные механизмы аутофагии и перспективы таргетной терапии БП на основе использования индукции аутофагии путем влияния на ключевые звенья этого процесса.

Поиск эффективных биомаркеров рака яичников является одним из актуальных направлений онкогинекологии. Метаболомное профилирование методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии позволяет получить информацию о совокупности всех низкомолекулярных метаболитов в образце биологической жидкости пациента. Эти метаболиты могут стать потенциальными маркерами заболевания, а комбинация с данными об уровне микроРНК значительно повышает их диагностичечскую значимость. С целью выявления потенциальных неинвазивных диагностических маркеров рака яичников изучен метаболомный профиль и уровень транскриптов микроРНК в моче больных серозной аденокарциномой яичников. В исследование вошли 60 пациенток с диагнозом серозная аденокарцинома яичников и 20 женщин без онкопатологии в анамнезе. Разделение метаболитов проводили на хроматографе Vanquish Flex UHPLC System, сопряженном с масс-спектрометром Orbitrap Exploris 480. Поиск генов-регуляторов метаболитов и микроРНК-регуляторов генов осуществляли с использованием метода машинного обучения Random forest. Уровень транскриптов микроРНК в моче определяли методом ПЦР в режиме реального времени. Для построения предсказательных моделей использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию. В моче больных раком яичника выявлена аномальная концентрация 26 соединений (кинуренина, фенилаланил-валина, лизофосфатидилхолинов 18:3, 18:2, 20:4 и 14:0, аланил-лейцина, L-фенилаланина, фосфатидилинозитола (34:1), 5-метокситриптофана, 2-гидроксимиристиновой кислоты, 3-оксохолевой кислоты, индолакриловой кислоты, лизофосфатидилсерина (20:4), L-бета-аспартил-L-фенилаланина, миристиновой кислоты, деканоилкарнитина, аспартил-глицина, малонилкарнитина, 3-гидроксибутирилкарнитина, 3-метилксантина, 2,6 диметилгептаноилкарнитина, 3-оксододекановой кислоты, N-ацетилпролина, L-октаноилкарнитина и каприлоилглицина). С использованием метода Random forest установлены взаимосвязи метаболит–ген-регулятор (47 генов) и метаболит–микроРНК-регулятор (613 уникальных микроРНК). Уровень 85 микроРНК в моче проанализирован методом ПЦР в режиме реального времени. Обнаружены изменения уровня транскриптов miR-382-5p, miR-593-3p, miR-29a-5p, miR-2110, miR-30c-5p, miR-181a-5p, let-7b-5p, miR-27a-3p, miR-370-3p, miR-6529-5p, miR-653-5p, miR-4742-5p, miR-2467-3p, miR-1909-5p, miR-6743-5p, miR-875-3p, miR-19a-3p, miR-208a-5p, miR-330-5p, miR-1207-5p, miR-4668-3p, miR-3193, miR-23a-3p, miR-12132, miR-765, miR-181b-5p, miR-4529-3p, miR-33b-5p, miR-17-5p, miR-6866-3p, miR-4753-5p, miR-103a-3p, miR-423-5p, miR-491-5p, miR-196b-5p, miR-6843-3p, miR-423-5p и miR-3184-5p в моче пациенток с раком яичника относительно контрольной группы. Таким образом, в моче больных раком яичника обнаружен значительный метаболомный дисбаланс, ассоциированный с изменениями уровней микроРНК, регулирующих сигнальные пути этих метаболитов. При этом 26 соединений с аномальной концентрацией и уровни транскриптов микроРНК miR-33b-5p, miR-423-5p, miR-6843-3p, miR-4668-3p, miR-30c-5p, miR-6743-5p, miR-4742-5p, miR-1207-5p и miR-17-5p в моче могут служить неинвазивными диагностическими маркерами рака яичников.

Изучена кинетика амплификации и особенности индивидуального и совместного встраивания модифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов в изотермической амплификации ДНК по типу катящегося кольца (RCA). В исследование вошли синтезированные нами шесть пар Су-5-меченных трифосфатов дезоксиуридина (dU) и дезоксицитидина (dC) с аналогичными электронейтральными флуоресцентными заместителями внутри пары, но различающихся для разных пар. Выявлено влияние длины линкера между флуорофором и пиримидиновым основанием на плотность встраивания: нуклеотиды с длиной линкера в шесть атомов углерода встраиваются в растущую цепь ДНК лучше, чем с тремя атомами углерода. Обнаружено, что совместное введение в реакцию трифосфатов в эквивалентной суммарной концентрации не усиливает ингибирующий эффект, что дает основания для более детального изучения одновременного применения флуоресцентно-меченных dU и dC.

Тиоцианатдегидрогеназа — фермент, катализирующий преобразование иона тиоцианата в ион цианата c выделением двух электронов, двух протонов и нейтрального атома серы. Ранее были решены структуры тиоцианатдегидрогеназы из Thioalkalivibrio paradoxus. Хотя качество этих структур не безупречно (двойникование и сильная анизотропия кристаллов, неполная заселенность ионов меди, отсутствие данных о строении комплексов с аналогами субстрата), на их основе ранее был предложен механизм функционирования фермента. Недавно с атомным разрешением были решены структуры генно-инженерной копии родственного свободного фермента из Pelomicrobium methylotrophicum и его комплекса с тиомочевиной. В новых структурах ионы меди активного центра имеют полную заселенность. В этих структурах удается надежно установить две конформации молекулы белка с открытым и закрытым активными центрами. Новые структурные данные высокого разрешения позволили также выявить в активных центрах фермента в каждой из этих конформаций суперпозиции состояний ионов меди с различными степенями окисления с частичными заселенностями (и соответствующих лигандов). Заряды ионов меди в этих состояниях определялись по координации ионов. В молекуле белка с закрытым активным центром наблюдаются комплексы с ингибитором (ионом тиомочевины) и молекулярным кислородом. Комплекс с тиомочевиной позволяет моделировать связывание ферментом иона тиоцианата. Предложен механизм активации атакующего кислородного лиганда, учитывающий изменения структур открытой и закрытой конформаций. Обсуждается новая схема ферментативной реакции.

Высокопроизводительные методы исследования транскриптома позволяют оценить огромное количество факторов, что ценно для ученых, но порождает проблему “проклятия размерности”, что повышает требования к методам обработки и анализа данных. В представленной работе мы предлагаем новый алгоритм, объединяющий методы Монте-Карло и машинное обучение. Этот алгоритм позволит сократить пространство признаков, подсвечивая гены, с наибольшей вероятностью ассоциированные с определенными заболеваниями. Представленный подход позволяет не только сформировать набор “интересных” генов, но и взвесить их множество, присвоив каждому гену меру его “важности”. Эта мера может быть использована как в последующем статистическом анализе, так и при визуализации и интерпретации результатов. Работа алгоритма продемонстрирована нами на открытых данных профилирования больных гипертрофической кардиомиопатией. По результатам анализа выявлены гены MYH6, FCN3, RASD1 и SERPINA3, что хорошо согласуется с опубликованными данными.

Анализу экспрессии генов иммунного ответа отводится важная роль в изучении взаимодействий организма-хозяина и инфекционного агента. Существует много подходов к проведению такого анализа, однако проблемой остается выбор единого стандарта для нормализации данных. В настоящей работе разработана основанная на мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени система анализа экспрессии генов HPRT1, SDHA, GAPDH и TBP, отобранных в качестве потенциальных референсных генов. С использованием алгоритмов geNorm и BestKeeper на основе экспрессии двух генов — HPRT1 и SDHA сформирован стабильный индекс, который применили при расчете нормализации уровня экспрессии генов Тоll-подобных рецепторов: TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 и TLR8. Значения экспрессии генов Тоll-подобных рецепторов в выборке условно здоровых лиц характеризовались высокой стабильностью и положительной взаимной корреляцией (за исключением TLR6), что может указывать на общие механизмы регуляции экспрессии этих генов и подтверждает возможность использования разработанной мультиплексной системы для анализа экспрессии генов иммунного ответа.