Динамика экспрессии трансгена в осповакцинном векторе MVA под контролем промоторов p11, p13.5, pLEO160, p7.5 и mH5, независимость уровня экспрессии трансгена от локуса встраивания

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), обладающий высокой иммуногенностью и доказанной безопасностью, считается перспективным в качестве вектора для разработки вакцин. Неоспоримым достоинством MVA-вектора является его большая емкость и возможность встраивания нескольких трансгенов в разные локусы вирусного генома, что позволяет создавать мультивалентные вакцины, кодирующие несколько антигенов одновременно. В настоящей работе изучена экспрессия трансгена, кодирующего эпитопы белков вируса гриппа, после его интеграции в пять локусов генома MVA. Показана независимость уровня экспрессии трансгена от локуса встраивания. Также определена динамика экспрессии репортерного гена, кодирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP), под контролем осповакцинных промоторов p11, p13.5, pLEO160, p7.5 и mH5 при встраивании экспрессионной кассеты в локус гена F13L MVA. Максимальный уровень экспрессии, но с более поздним началом синтеза белка, обеспечивал поздний промотор р11. Использование промотора р13.5 приводило к более раннему синтезу белка EGFP в клетке и более высокому уровню экспрессии гена, чем при использовании промоторов pLEO160, p7.5 и mH5, которые обеспечивали одинаковый уровень и динамику экспрессии репортерного гена. Полученные данные могут быть полезны для создания векторных MVA-вакцин, содержащих несколько антигенов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

О. В. Орлова

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Автор, ответственный за переписку.
Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва

Д. В. Глазкова

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва

О. Н. Сидорова

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва

Ф. А. Урусов

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства; Научно-исследовательский институт медицины труда им. академика Н.Ф. Измерова

Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва; Москва

Г. А. Шипулин

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва

Е. В. Богословская

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: oorlova@cspmz.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Orlova O.V., Glazkova D.V., Bogoslovskaya E.V., Shipulin G.A., Yudin S.M. (2022) Development of modified vaccinia virus Ankara-based vaccines: advantages and applications. Vaccines. 10(9), 1516.
  2. Volz A., Sutter G. (2016) Modified vaccinia virus Ankara: history, value in basic research, and current perspectives for vaccine development. Adv. Virus Res. 97, 187–243.
  3. Rashidi A., La Rosa C., Curtsinger J., Cao Q., Zhou Q. (2022) CMV Triplex vaccine to enhance adaptive NK and T-cell reconstitution after autologous hematopoietic cell transplantation. Transplant. Cell Ther. 28(6), 343.e1–343.e4.
  4. Manuel E., Wang Z., Li Z., La Rosa C., Zhou W., Diamond D.J. (2010) Intergenic region 3 of modified vaccinia Ankara is a functional site for insert gene expression and allows for potent antigen-specific immune responses. Virology. 403(2), 155–162.
  5. Atukorale V.N., Weir J.P., Meseda C.A. (2020) Stability of the HSV-2 US-6 gene in the del II, del III, CP77, and I8R-G1L sites in modified vaccinia virus Ankara after serial passage of recombinant vectors in cells. Vaccines. 8(1), 137.
  6. Stittelaar K.J., Wyatt L.S., de Swart R.L., Vos H.W., Groen J. (2000) Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus Ankara-based measles virus vaccine in the presence of passively acquired antibodies. J. Virol. 74(9), 4236–4243.
  7. Patent AU2007200016A1. (2027) Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of modified vaccinia virus Ankara. https://patents.google.com/patent/AU2007200016A1/en
  8. Weir J.P., Moss B. (1987) Determination of the promoter region of an early vaccinia virus gene encoding thymidine kinase. Virology. 158(1), 206–210.
  9. Coupar B.E., Boyle D.B., Both G.W. (1987) Effect of in vitro mutations in a vaccinia virus early promoter region monitored by herpes simplex virus thymidine kinase expression in recombinant vaccinia virus. J. Gen. Virol. 68, 2299–2309.
  10. Wittek R., Hänggi M., Hiller G. (1984) Mapping of a gene coding for a major late structural polypeptide on the vaccinia virus genome. J. Virol. 49(2), 371–378.
  11. Mackett M., Smith G.L., Moss B. (1984) General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J. Virol. 49(3), 857–864.
  12. Wyatt L.S., Shors S.T., Murphy B.R., Moss B. (1996) Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. Vaccine. 14(15), 1451–1458.
  13. Wennier S.T., Brinkmann K., Steinhäußer C., Mayländer N., Mnich C., Wielert U., Dirmeier U., Hausmann J., Chaplin P., Steigerwald R. (2013) A novel naturally occurring tandem promoter in modified vaccinia virus Аnkara drives very early gene expression and potent immune responses. PLoS One. 8(8), e73511.
  14. Lopera-Madrid J., Medina-Magües L.G., Gladue D.P., Borca M.V., Osorio J.E. (2021) Optimization in the expression of ASFV proteins for the development of subunit vaccines using poxviruses as delivery vectors. Sci. Rep. 11(1), 23476.
  15. Di Pilato M., Mejías-Pérez E., Gómez C.E., Perdiguero B., Sorzano C.O., Esteban M. (2013) New vaccinia virus promoter as a potential candidate for future vaccines. J. Gen. Virol. 94, 2771–2776.
  16. Sancho M.C., Schleich S., Griffiths G., Krijnse-Locker J. (2002) The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J. Virol. 76(16), 8318–8334.
  17. Gilbert S.C. (2013) Clinical development of modified vaccinia virus Ankara vaccines. Vaccine. 31(39), 4241–4246.
  18. Baur K., Brinkmann K., Schweneker M., Pätzold J., Meisinger-Henschel C., Hermann J., Steigerwald R., Chaplin P., Suter M., Hausmann J. (2010) Immediate-early expression of a recombinant antigen by modified vaccinia virus ankara breaks the immunodominance of strong vector-specific B8R antigen in acute and memory CD8 T-cell responses. J. Virol. 84(17), 8743–8752.
  19. Pilato M.D., Sánchez-Sampedro L., Mejías-Pérez E., Sorzano C., Esteban M. (2015) Modification of promoter spacer length in vaccinia virus as a strategy to control the antigen expression. J. Gen. Virol. 96(8), 2360–2371.
  20. Pérez P., Marín M.Q., Lázaro-Frías A., Sorzano C.O., Di Pilato M., Gómez C.E., Esteban M., García-Arriaza J. (2019) An MVA vector expressing HIV-1 envelope under the control of a potent vaccinia virus promoter as a promising strategy in HIV/AIDS vaccine design. Vaccines. 7(4), 208.
  21. Alharbi N.K. (2019) Poxviral promoters for improving the immunogenicity of MVA delivered vaccines. Hum. Vaccin. Immunother. 15, 203–209.
  22. Wyatt L.S., Earl P.L., Vogt J., Eller L.A., Chandran D., Liu J., Robinson H.L., Moss B. (2008) Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine. 26(4), 486–493.
  23. Mintaev R.R., Glazkova D.V., Orlova O.V., Bogoslovskaya E.V., Shipulin G.A. (2022) Development of a universal epitope-based influenza vaccine and evaluation of its effectiveness in mice. Vaccines. 10(4), 534.
  24. Antoshkina I.V., Glazkova D.V., Urusov F.A., Bogoslovskaya E.V., Shipulin G.A. (2022) Comparison of recombinant MVA selection methods based on F13L, D4R and K1L genes. Viruses. 4(3), 528.
  25. Mintaev R.R., Glazkova D.V., Orlova O.V., Ignatyev G.M., Oksanich A.S., Shipulin G.A., Bogoslovskaya E.V. (2023) Development of MVA-d34 tetravalent dengue vaccine: design and immunogenicity. Vaccines. 11(4), 831.
  26. Orlova O.V., Glazkova D.V., Mintaev R.R., Tsyganova G.M., Urusov F.A., Shipulin G.A., Bogoslovskaya E.V. (2023) Comparative evaluation of the activity of various lentiviral vectors containing three anti-HIV genes. Microorganisms. 11(4), 1053.
  27. Staib C., Drexler I., Sutter G. (2004) Construction and isolation of recombinant MVA. Meth. Mol. Biol. 269, 77–100.
  28. Kremer M., Volz A., Kreijtz J., Fux R., Lehmann M.H., Sutter G. (2012) Easy and efficient protocols for working with recombinant vaccinia virus MVA. Meth. Mol. Biol. 890, 59–92.
  29. Sánchez-Puig J., Blasco R. (2005) Isolation of vaccinia MVA recombinants using the viral F13L gene as the selective marker. Biotechniques. 39(5), 665–666.
  30. Ricci P.S., Schäfer B., Kreil T.R., Falkner F.G., Holzer G.W. (2011) Selection of recombinant MVA by rescue of the essential D4R gene. J. Virol. 12(8), 529.
  31. Scheiflinger F., Falkner F.G., Dorner F. (1996) Evaluation of the thymidine kinase (tk) locus as an insertion site in the highly attenuated vaccinia MVA strain. Arch. Virol. 141(3–4), 663–669.
  32. Hessel A., Savidis-Dacho H., Coulibaly S., Portsmouth D., Kreil T.R., Crowe B.A., Schwendinger M.G., Pilz A., Barrett P.N., Falkner F.G., Schäfer B. (2014) MVA vectors expressing conserved influenza proteins protect mice against lethal challenge with H5N1, H9N2 and H7N1 viruses. PLoS One. 9(2), e88340.
  33. Sabbaghi A., Ghaemi A. (2021) Molecular adjuvants for DNA vaccines: application, design, preparation, and formulation. Meth. Mol. Biol. 2197, 87–112.
  34. Morelli M.P., Zajac M.P., Pellegrini J.M., Amiano N.O., Tateosian N.L., Calamante G., Gherardi M.M., García V.E. (2020) IL-12 DNA displays efficient adjuvant effects improving immunogenicity of Ag85A in DNA Prime/MVA boost immunizations. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10, 581812.
  35. Kreiter S., Diken M., Selmi A., Petschenka J., Türeci O., Sahin U. (2016) FLT3 ligand as a molecular adjuvant for naked RNA vaccines. Meth. Mol. Biol. 1428, 163–175.
  36. Orubu T., Alharbi N.K., Lambe T., Gilbert S.C., Cottingham M.G. (2012) Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA. PLoS One. 7, e40167.
  37. Davison A.J., Moss B. (1989) Structure of vaccinia virus early promoters. J. Mol. Biol. 210, 749–769.
  38. Staib C., Drexler I., Ohlmann M., Wintersperger S., Erfle V., Sutter G. (2000) Transient host range selection for genetic engineering of modified vaccinia virus Ankara. BioTechniques. 28, 1137–1148.
  39. Hall Y.H.J. (2016) Promoter and leader sequence effects on immunological potency of recombinant modified vaccinia virus Ankara delivering tuberculosis antigens. PhD thesis. The Open University. https://oro.open.ac.uk/61260/1/13834601.pdf
  40. Müller K. (2018) Сharacterization of vaccinia virus MVA candidate vaccines mutated in viral genes modulating inflammasome activation. Ludwig Maximilian Univ. Munich. Munich. https://edoc.ub.uni-muenchen.de/22017/
  41. Dai L. (2014) Generation, characterization and application of a novel BAC system for MVA mutagenesis to investigate the function of vaccinia virus immune modulatory gene N1L. Technical Univ. Munich. Munich. https://mediatum.ub.tum.de/doc/1191773/1191773.pdf

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. а – Схема расположения локусов 007/008, F13L, TK, D4R, 136/137 в геноме MVA. GOI – анализируемый ген. б – Схема челночного вектора для F13L-системы селекции. Левое плечо – левое плечо гомологии с локусом F13L. Промотор – место расположения одного из пяти промоторов (p7.5; mH5; p13.5; p11; pLEO160). EGFP – последовательность, кодирующая белок EGFP. Сайт терминации транскрипции. Правое плечо – правое плечо гомологии с локусом F13L; показаны сайты рестрикции BamHI, NheI и EcoRI. в – Схема встраивания челночных векторов в локус F13L вектора rMVAΔF13L.

Скачать (223KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Стратегия гейтирования для определения EGFP-положительных клеток среди клеток HEK293FT, трансдуцированных rMVA-p7.5-EGFP.

Скачать (526KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Вестерн-блот-анализ синтеза полипептида k2 в клетках HEK293FT, инфицированных rMVA-F13L-k2, rMVA-D4R-k2, rMVA-007/008-k2, rMVA-136/137-k2, rMVA-tk-k2 или MVA дикого типа (WT). WT использовали в качестве отрицательного контроля для клеток, инфицированных rMVA. Масса полипептида k2 – 31 кДа.

Скачать (89KB)
Метаданные
5. Рис. 4. a – Динамика синтеза EGFP под контролем различных промоторов. Содержание (%) EGFP+ клеток в динамике. б–в – Интенсивность флуоресценции в инфицированных клетках в популяции EGFP+ (б) и во всей популяции клеток (в), нормированная на MFI клеток в момент заражения каждым rMVA. Показаны средние значения и стандартные отклонения, вычисленные по результатам трех опытов.

Скачать (691KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Выравнивание промоторов p7.5 и mH5. Vaccinia – фрагмент геномной последовательности вируса осповакцины (GeneBank accession number NC_006998). Dai L., 2014 и Wyatt L.S., 1996 – последовательности промоторов, использованные в соответствующих публикациях.

Скачать (532KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025