THE STATE OF BONE MARROW IN THE RATS FOLLOWING THE COMBINED LASER IRRADIATION IN THE INFRARED AND RED WAVELENGTH RANGES OF THE LIGHT SPECTRUM

Full Text

Лазерное излучение низких интенсивностей широко применяется в области травматологии, спортивной медицины и пластической хирургии для восстановления структурно-функциональных нарушений в органах и тканях, включая скелетную мышечную ткань [1-4]. Для улучшения результатов лазеротерапии иногда применяется комбинированное воздействие лазерами, излучающими в различных областях светового спектра и разных частотных режимах, а также имеющими различную глубину проникновения в биологические ткани, например в инфракрасном и красном диапазонах [2, 5, 6]. При лазеротерапии скелетных мышц локальному воздействию лазерных лучей подвергается костный мозг. Согласно данным литературы, лазерное излучение может оказывать на костный мозг как стимулирующий, так и угнетающий эффект в зависимости от дозы и режима облучения. При сравнительно высоких дозах лазерного облучения (ЛО) некоторые исследователи наблюдали гибель клеток костного мозга, подавление колониеобразующей способности и пролиферативной активности мезенхимных стволовых клеток, а также увеличение ретикулоцитов с микроядрами, появление полиплоидных клеток и аберраций хроматидного типа уже после 3-5 сеансов ЛО бедренной косточки красным или инфракрасным лазерами [7-11]. Клетки костного мозга, как известно, участвуют в физиологической и посттравматической регенерации мышц, обеспечивают кроветворение [12-14]. В связи с этим исследование функционального состояния костного мозга в условиях лазеротерапии скелетных мышц становится актуальным. Целью данной работы было определить влияние комбинированного ЛО в инфракрасном и красном диапазонах светового спектра на состояние клеток костного мозга при облучении в различных дозах обеих задних конечностей крыс. Материал и методы Эксперимент проведен на 15 беспородных крысах-самцах в возрасте 3-4 мес. Животных разделили на 3 группы по 5 крыс в каждой. У подопытных крыс на обеих задних конечностях с дорсальной стороны сбривали шерсть и в течение 2 нед каждую голень животного в области проекции икроножных мышц подвергали 10-кратному ЛО (5 процедур в инфракрасном диапазоне светового спектра и 5 процедур в красном диапазоне). Процедуры с импульсным инфракрасным лазером и непрерывно излучающим красным лазером ежедневно чередовали. В опыте 1 длительность процедуры составляла 1 мин на каждую конечность крысы, в опыте 2 - соответственно 3 мин. Контроль служили необлученные крысы того же возраста. Условия воздействия импульсным инфракрасным лазером: аппарат ОРИОН-5 (ВНПП «Жива»), длина волны 890 нм, частота следования импульсов 1500 Гц, выходная импульсная мощность лазера 8 Вт. Режим облучения контактный лабильный. Каждую голень крысы с дорсальной поверхности облучали от проксимального конца к дистальному концу и обратно по несколько раз (в зависимости от длительности процедуры). Площадь облучения излучателя на поверхности голени составляла 1,5 см2 при каждом контакте в течение 1 с, доза облучения - 0,0008 Дж/см2. В опыте 1 при облучении каждой голени животного было по 60 контактов, в опыте 2 - по 180. Условия воздействия лазером, непрерывно излучающим в красном диапазоне: стационарная установка ОКГ-12 (Россия), длина волны - 632,8 нм, режим облучения дистанционный. На выходе лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2-2,5 см, плотность мощности 2,5-3 мВт/см2. В опыте 1 доза облучения каждой конечности животного в течение одной процедуры равнялась 0,15-0,18 Дж/см2, в опыте 2 - 0,45-0,54 Дж/см2. Экспериментальный материал анализировали на следующий день после завершения курсового ЛО. Большеберцовую кость голени фиксировали в смеси Карнуа. Затем из большеберцовых косточек извлекали фрагменты костного мозга, промывали в течение 1-2 мин в дистиллированной воде, переносили в ацетокармин и во влажной камере держали в холодильнике в течение 3-5 сут. После этого готовили временные препараты: небольшой кусочек ткани помещали на предметное стекло в каплю хлоралгидрата, накрывали покровным стеклом и слегка надавливали. Анализировали по несколько кусочков из каждой голени. Количество клеток с нарушениями митоза определяли в костно-мозговой ткани правой и левой большеберцовых косточек ана-телофазным методом, учитывая анафазы и ранние телофазы. Общее количество подсчитанных анафаз - телофаз у животного составляло в среднем 600-700 клеток. Хромосомные аберрации (ХА) выражали в процентах от общего количества ана-телофаз. При определении клеток с ХА учитывали митозы с мостами (не разошедшимися к полюсам митоза) и фрагментами (свободно лежащими небольшими участками хромосом и мелкими хромосомными фрагментами), а также со смешанной патологией (мосты и фрагменты в одной клетке). Митозы с значительно отстающими концами хромосом при расхождении к полюсам («хвосты» разной длины и слипшиеся концы хромосом) рассматривали как прочие нарушения (см. рисунок). Количественные данные обрабатывали статистически, различия средних величин оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Исследования выполнены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы получали стандартный гранулированный комбикорм и воду в свободном доступе. Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Результаты По условиям эксперимента на каждую голень крысы в течение 10 процедур поочередно воздействовали ЛО разной интенсивности и глубины проникновения в ткани. Результаты количественного анализа клеток костного мозга представлены в таблице. Показано, что у контрольных крыс количество нормальных митозов в клетках костного мозга составляло 74,0 ± 1,8%. Среди митозов с мостами, фрагментами и смешанной патологией на долю мостов приходилось 58%, фрагментов хромосом - 31%, митозов со смешанной патологией - 11%. Преобладали клетки с одним мостом. В опыте 1 поочередное воздействие импульсным инфракрасным лазером (890 нм, 1500 Гц, 5 процедур) и непрерывно излучающим красным лазером (632,8 нм, 5 процедур) по 1 мин вызывало в клетках костного мозга лишь тенденцию к увеличению количества митозов с нарушениями по сравнению с контрольными животными. При этом количество анафаз - телофаз с мостами, фрагментами и смешанной патологией составляло 71, 24 и 5% соответственно. Число прочих аберраций (митозов со слипшимися и значительно отстающими концами хромосом при расхождении их к полюсам) практически не изменилось, можно говорить о снижении средней величины данного показателя. В опыте 2 после 10-кратного воздействия по 3 мин поочередно импульсным инфракрасным лазером (890 нм, 1500 Гц, 5 сеансов) и непрерывно излучающим красным лазером (632,8 нм, 5 сеансов) наблюдалось достоверное увеличение количества аберрантных митозов в клетках костного мозга по сравнению с контрольными крысами. При этом в спектре нарушений количество митозов с мостами, фрагментами и смешанной патологией равнялось 66, 26 и 8% соответственно. Величина прочих аберраций (митозы со слипшимися и значительно отстающими концами хромосом) оставалась на уровне контроля. Обсуждение Полученные результаты показали, что комбинированное применение инфракрасного лазера с частотой излучения 1500 Гц и непрерывно излучающего красного лазера в изученном режиме (10 процедур, ежедневное чередование сеансов ЛО разной интенсивности и глубины проникновения в биологические ткани) оказывало дестабилизирующее воздействие на хромосомный аппарат клеток костного мозга. Сравнивая результаты в опыте 1 и опыте 2, можно заметить, что эффект определялся интенсивностью ЛО. В опыте 2 при трехкратном увеличении интенсивности ЛО количество митозов с патологией в клетках костного мозга было достоверно выше, чем в опыте 1 (p < 0,02). Особенности спектра патологий в делящихся клетках костного мозга также указывают на большую эффективность малых доз ЛО при комбинированном применении инфракрасного и красного лазеров в данных условиях эксперимента. В опыте 1 чаще встречались митозы с мостами и реже - с фрагментами и смешанной патологией (мосты и фрагменты в одной клетке) по сравнению с контролем. Считается, что большая частота встречаемости митозов с мостами по сравнению с фрагментами указывает на более высокую активность репарационных систем в клетках [15]. В опыте 2 в спектре патологий аберрантные митозы с мостами встречались сравнительно реже, чем в опыте 1, и среди этих клеток отмечались митозы, содержащие по 3-4 моста. Число митозов, отнесенных в разряд прочих аберраций (слипшиеся хромосомы и значительно отстающие концы хромосом при расхождении к полюсам митоза), было практически одинаковым в клетках костного мозга в контроле, опыте 1 и опыте 2. Отстающие медленно подтягивающиеся к полюсам митотического веретена «хвосты» хромосом разной длины возникают в результате того, что к концу анафазы - в начале телофазы мосты обычно чрезмерно растягиваются и быстро рвутся. В этом случае деление клетки постепенно завершается, но распределение хромосомного материала может нарушаться или быть нормальным. Эффект инфракрасного и красного лазеров был изучен в дозах, традиционно применяемых в клинической практике для восстановления органов и тканей с патологическими изменениями [16]. Наши результаты могут указывать на то, что в данном режиме комбинированного поочередного воздействия импульсного лазера (890 нм, 1500 Гц) и красного непрерывного лазера (632,8 нм) на каждую заднюю конечность по 10 процедур в течение 2 нед были превышены терапевтический коридор лазеротерапии, допустимая энергетическая облученность. Это предположение подтверждается тем, что каждый из этих вариантов ЛО, примененный в дозах и режиме, близких к условиям данного эксперимента, оказывает стимулирующее действие на восстановление клеток костного мозга даже после облучения их ионизирующей радиацией. Так, нами показано снижение хромосомных аберраций в клетках костного мозга при воздействии импульсного инфракрасного лазера на обе голени крыс, локально облученные в дозе 20 Гр [17], а также непрерывно излучающего красного лазера с длиной волны 632,8 нм у крыс, тотально облученных ионизирующей радиацией в дозе 6 Гр [18]. Не исключено, что положительное влияние на клетки костного мозга в условиях комбинированного облучения инфракрасным и красным лазерами выявится позднее. В данном исследовании цитогенетический анализ клеток костного мозга проводили на следующие сутки после завершения курса ЛО. Однако состояние костного мозга, как известно, может постепенно улучшаться за счет элиминации клеток с повреждениями и замещения их активно пролиферирующими стволовыми клетками. Заключение Показано, что комбинированное ЛО обеих голеней крыс при ежедневном чередовании импульсного инфракрасного лазера (890 нм, 1500 Гц) и непрерывного красного (632,8 нм) лазера, излучающих в различных областях спектра и разных частотных режимах, а также имеющих различную глубину проникновения в биологические ткани, может вызывать нарушения митотического деления в клетках костного мозга. Очевидно, эффект определяется превышением максимальной дозы ЛО. Эти данные указывают на то, что в ряде случаев при проведении лазерной терапии могут наблюдаться побочные эффекты. Полученные результаты актуальны в связи с тем, что в клинической практике выбор адекватной дозы, щадящего режима лазеротерапии с учетом тяжести заболевания, исходного состояния пациента и системного влияния ЛО на организм в целом до сих пор носит эмпирический характер, и, следовательно, возможны превышения пороговых норм лазерной терапии.

About the authors

Nelly V. Bulyakova

Federal state budgetary institution of science «A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution», Russian Academy of Sciences

Email: bulyakova38@mail.ru
Federal state budgetary institution of science «A.N.Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution», Russian Academy of Sciences, 119071, Moscow 119071, Moscow, Russia

V. S Azarova

Federal state budgetary institution of science «A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution», Russian Academy of Sciences

119071, Moscow, Russia

References

Supplementary files