СОСТОЯНИЕ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ КОМБИНИРОВАННОГО ЛАЗЕРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ В ИНФРАКРАСНОМ И КРАСНОМ ДИАПАЗОНАХ СВЕТОВОГО СПЕКТРА

Полный текст

Лазерное излучение низких интенсивностей широко применяется в области травматологии, спортивной медицины и пластической хирургии для восстановления структурно-функциональных нарушений в органах и тканях, включая скелетную мышечную ткань [1-4]. Для улучшения результатов лазеротерапии иногда применяется комбинированное воздействие лазерами, излучающими в различных областях светового спектра и разных частотных режимах, а также имеющими различную глубину проникновения в биологические ткани, например в инфракрасном и красном диапазонах [2, 5, 6]. При лазеротерапии скелетных мышц локальному воздействию лазерных лучей подвергается костный мозг. Согласно данным литературы, лазерное излучение может оказывать на костный мозг как стимулирующий, так и угнетающий эффект в зависимости от дозы и режима облучения. При сравнительно высоких дозах лазерного облучения (ЛО) некоторые исследователи наблюдали гибель клеток костного мозга, подавление колониеобразующей способности и пролиферативной активности мезенхимных стволовых клеток, а также увеличение ретикулоцитов с микроядрами, появление полиплоидных клеток и аберраций хроматидного типа уже после 3-5 сеансов ЛО бедренной косточки красным или инфракрасным лазерами [7-11]. Клетки костного мозга, как известно, участвуют в физиологической и посттравматической регенерации мышц, обеспечивают кроветворение [12-14]. В связи с этим исследование функционального состояния костного мозга в условиях лазеротерапии скелетных мышц становится актуальным. Целью данной работы было определить влияние комбинированного ЛО в инфракрасном и красном диапазонах светового спектра на состояние клеток костного мозга при облучении в различных дозах обеих задних конечностей крыс. Материал и методы Эксперимент проведен на 15 беспородных крысах-самцах в возрасте 3-4 мес. Животных разделили на 3 группы по 5 крыс в каждой. У подопытных крыс на обеих задних конечностях с дорсальной стороны сбривали шерсть и в течение 2 нед каждую голень животного в области проекции икроножных мышц подвергали 10-кратному ЛО (5 процедур в инфракрасном диапазоне светового спектра и 5 процедур в красном диапазоне). Процедуры с импульсным инфракрасным лазером и непрерывно излучающим красным лазером ежедневно чередовали. В опыте 1 длительность процедуры составляла 1 мин на каждую конечность крысы, в опыте 2 - соответственно 3 мин. Контроль служили необлученные крысы того же возраста. Условия воздействия импульсным инфракрасным лазером: аппарат ОРИОН-5 (ВНПП «Жива»), длина волны 890 нм, частота следования импульсов 1500 Гц, выходная импульсная мощность лазера 8 Вт. Режим облучения контактный лабильный. Каждую голень крысы с дорсальной поверхности облучали от проксимального конца к дистальному концу и обратно по несколько раз (в зависимости от длительности процедуры). Площадь облучения излучателя на поверхности голени составляла 1,5 см2 при каждом контакте в течение 1 с, доза облучения - 0,0008 Дж/см2. В опыте 1 при облучении каждой голени животного было по 60 контактов, в опыте 2 - по 180. Условия воздействия лазером, непрерывно излучающим в красном диапазоне: стационарная установка ОКГ-12 (Россия), длина волны - 632,8 нм, режим облучения дистанционный. На выходе лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2-2,5 см, плотность мощности 2,5-3 мВт/см2. В опыте 1 доза облучения каждой конечности животного в течение одной процедуры равнялась 0,15-0,18 Дж/см2, в опыте 2 - 0,45-0,54 Дж/см2. Экспериментальный материал анализировали на следующий день после завершения курсового ЛО. Большеберцовую кость голени фиксировали в смеси Карнуа. Затем из большеберцовых косточек извлекали фрагменты костного мозга, промывали в течение 1-2 мин в дистиллированной воде, переносили в ацетокармин и во влажной камере держали в холодильнике в течение 3-5 сут. После этого готовили временные препараты: небольшой кусочек ткани помещали на предметное стекло в каплю хлоралгидрата, накрывали покровным стеклом и слегка надавливали. Анализировали по несколько кусочков из каждой голени. Количество клеток с нарушениями митоза определяли в костно-мозговой ткани правой и левой большеберцовых косточек ана-телофазным методом, учитывая анафазы и ранние телофазы. Общее количество подсчитанных анафаз - телофаз у животного составляло в среднем 600-700 клеток. Хромосомные аберрации (ХА) выражали в процентах от общего количества ана-телофаз. При определении клеток с ХА учитывали митозы с мостами (не разошедшимися к полюсам митоза) и фрагментами (свободно лежащими небольшими участками хромосом и мелкими хромосомными фрагментами), а также со смешанной патологией (мосты и фрагменты в одной клетке). Митозы с значительно отстающими концами хромосом при расхождении к полюсам («хвосты» разной длины и слипшиеся концы хромосом) рассматривали как прочие нарушения (см. рисунок). Количественные данные обрабатывали статистически, различия средних величин оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Исследования выполнены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы получали стандартный гранулированный комбикорм и воду в свободном доступе. Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Результаты По условиям эксперимента на каждую голень крысы в течение 10 процедур поочередно воздействовали ЛО разной интенсивности и глубины проникновения в ткани. Результаты количественного анализа клеток костного мозга представлены в таблице. Показано, что у контрольных крыс количество нормальных митозов в клетках костного мозга составляло 74,0 ± 1,8%. Среди митозов с мостами, фрагментами и смешанной патологией на долю мостов приходилось 58%, фрагментов хромосом - 31%, митозов со смешанной патологией - 11%. Преобладали клетки с одним мостом. В опыте 1 поочередное воздействие импульсным инфракрасным лазером (890 нм, 1500 Гц, 5 процедур) и непрерывно излучающим красным лазером (632,8 нм, 5 процедур) по 1 мин вызывало в клетках костного мозга лишь тенденцию к увеличению количества митозов с нарушениями по сравнению с контрольными животными. При этом количество анафаз - телофаз с мостами, фрагментами и смешанной патологией составляло 71, 24 и 5% соответственно. Число прочих аберраций (митозов со слипшимися и значительно отстающими концами хромосом при расхождении их к полюсам) практически не изменилось, можно говорить о снижении средней величины данного показателя. В опыте 2 после 10-кратного воздействия по 3 мин поочередно импульсным инфракрасным лазером (890 нм, 1500 Гц, 5 сеансов) и непрерывно излучающим красным лазером (632,8 нм, 5 сеансов) наблюдалось достоверное увеличение количества аберрантных митозов в клетках костного мозга по сравнению с контрольными крысами. При этом в спектре нарушений количество митозов с мостами, фрагментами и смешанной патологией равнялось 66, 26 и 8% соответственно. Величина прочих аберраций (митозы со слипшимися и значительно отстающими концами хромосом) оставалась на уровне контроля. Обсуждение Полученные результаты показали, что комбинированное применение инфракрасного лазера с частотой излучения 1500 Гц и непрерывно излучающего красного лазера в изученном режиме (10 процедур, ежедневное чередование сеансов ЛО разной интенсивности и глубины проникновения в биологические ткани) оказывало дестабилизирующее воздействие на хромосомный аппарат клеток костного мозга. Сравнивая результаты в опыте 1 и опыте 2, можно заметить, что эффект определялся интенсивностью ЛО. В опыте 2 при трехкратном увеличении интенсивности ЛО количество митозов с патологией в клетках костного мозга было достоверно выше, чем в опыте 1 (p < 0,02). Особенности спектра патологий в делящихся клетках костного мозга также указывают на большую эффективность малых доз ЛО при комбинированном применении инфракрасного и красного лазеров в данных условиях эксперимента. В опыте 1 чаще встречались митозы с мостами и реже - с фрагментами и смешанной патологией (мосты и фрагменты в одной клетке) по сравнению с контролем. Считается, что большая частота встречаемости митозов с мостами по сравнению с фрагментами указывает на более высокую активность репарационных систем в клетках [15]. В опыте 2 в спектре патологий аберрантные митозы с мостами встречались сравнительно реже, чем в опыте 1, и среди этих клеток отмечались митозы, содержащие по 3-4 моста. Число митозов, отнесенных в разряд прочих аберраций (слипшиеся хромосомы и значительно отстающие концы хромосом при расхождении к полюсам митоза), было практически одинаковым в клетках костного мозга в контроле, опыте 1 и опыте 2. Отстающие медленно подтягивающиеся к полюсам митотического веретена «хвосты» хромосом разной длины возникают в результате того, что к концу анафазы - в начале телофазы мосты обычно чрезмерно растягиваются и быстро рвутся. В этом случае деление клетки постепенно завершается, но распределение хромосомного материала может нарушаться или быть нормальным. Эффект инфракрасного и красного лазеров был изучен в дозах, традиционно применяемых в клинической практике для восстановления органов и тканей с патологическими изменениями [16]. Наши результаты могут указывать на то, что в данном режиме комбинированного поочередного воздействия импульсного лазера (890 нм, 1500 Гц) и красного непрерывного лазера (632,8 нм) на каждую заднюю конечность по 10 процедур в течение 2 нед были превышены терапевтический коридор лазеротерапии, допустимая энергетическая облученность. Это предположение подтверждается тем, что каждый из этих вариантов ЛО, примененный в дозах и режиме, близких к условиям данного эксперимента, оказывает стимулирующее действие на восстановление клеток костного мозга даже после облучения их ионизирующей радиацией. Так, нами показано снижение хромосомных аберраций в клетках костного мозга при воздействии импульсного инфракрасного лазера на обе голени крыс, локально облученные в дозе 20 Гр [17], а также непрерывно излучающего красного лазера с длиной волны 632,8 нм у крыс, тотально облученных ионизирующей радиацией в дозе 6 Гр [18]. Не исключено, что положительное влияние на клетки костного мозга в условиях комбинированного облучения инфракрасным и красным лазерами выявится позднее. В данном исследовании цитогенетический анализ клеток костного мозга проводили на следующие сутки после завершения курса ЛО. Однако состояние костного мозга, как известно, может постепенно улучшаться за счет элиминации клеток с повреждениями и замещения их активно пролиферирующими стволовыми клетками. Заключение Показано, что комбинированное ЛО обеих голеней крыс при ежедневном чередовании импульсного инфракрасного лазера (890 нм, 1500 Гц) и непрерывного красного (632,8 нм) лазера, излучающих в различных областях спектра и разных частотных режимах, а также имеющих различную глубину проникновения в биологические ткани, может вызывать нарушения митотического деления в клетках костного мозга. Очевидно, эффект определяется превышением максимальной дозы ЛО. Эти данные указывают на то, что в ряде случаев при проведении лазерной терапии могут наблюдаться побочные эффекты. Полученные результаты актуальны в связи с тем, что в клинической практике выбор адекватной дозы, щадящего режима лазеротерапии с учетом тяжести заболевания, исходного состояния пациента и системного влияния ЛО на организм в целом до сих пор носит эмпирический характер, и, следовательно, возможны превышения пороговых норм лазерной терапии.

Об авторах

Нелли Васильевна Булякова

ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова» РАН

Email: bulyakova38@mail.ru
канд. биол. наук, ст. науч. сотр., лаборатория морфологических адаптаций позвоночных, ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова» РАН, 119071 119071, Москва, Россия

В. С Азарова

ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова» РАН

119071, Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы