The state of the thymus and bone marrow in the rats following laser irradiation of the skeletal muscles and physical load on the irradiated animals

Full Text

Введение В настоящее время для устранения структурно-функциональных нарушений в скелетных мышцах широко применяются лазеры низкой интенсивности, в том числе в спортивной медицине. Воздействие лазерного излучения на мышцы спортсменов до и после тяжелых физических нагрузок ускоряет процессы реабилитации в скелетных мышцах, снижает болевые ощущения, стимулирует микроциркуляцию и ангиогенез, улучшает метаболизм мышечной ткани, снижает утомляемость скелетных мышц, а также повышает их выносливость к физическим нагрузкам [1-4]. По мнению некоторых исследователей, сочетанное воздействие лазерного излучения различных длины волны и дозы на скелетные мышцы может значительно повышать их адаптацию [5]. Вместе с тем установлено, что увеличение объема тренировок, а также предельных физических нагрузок и стрессовых воздействий в период спортивных соревнований вызывает «спортивный иммунодефицит», что выражается в снижении защитных сил организма к инфекциям и подавлении функции некоторых показателей иммунитета [6-9]. Как известно, лазерные лучи в зависимости от области облучения, длины волны, дозы и режима воздействия могут оказывать как стимулирующее, так и угнетающее действие на органы иммунной системы, в частности тимус и костный мозг. Так, некоторые исследователи отмечали структурные нарушения в тимусе, селезенке и лимфоузлах крысы после продолжительного воздействия лучей He-Ne-лазера на наружную поверхность бедра [10], ингибирующее воздействие на В-систему иммунитета, подавление активности антителообразования у мышей при облучении крови путем внутривенного введения моноволоконного оптического световода [11], снижение выработки тимусных гормонов [12, 13]. Имеются данные, свидетельствующие об ингибирующем воздействии лазерного излучения на численность мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, о снижении эритропоэза и усилении внутрисосудистого гемолиза эритроцитов [14, 15]. Некоторые исследователи отмечали в костном мозге крыс появление полиплоидных клеток, аберраций хроматидного типа и увеличение ретикулоци- тов с микроядрами уже после 3-5 сеансов лазерного облучения бедренной косточки He-Ne-лазерами или инфракрасными (ИК) лазерами [16, 17]. Целью данной работы было оценить реакцию иммунной системы крыс (тимуса и костного мозга) на сочетанное воздействие излучения ИК- и He-Ne-лазеров в течение 2 нед на область проекции икроножных мышц и у облученных в таком же режиме животных после физической нагрузки. Материал и методы Эксперимент проведен на 15 беспородных крысах- самцах в возрасте 2 мес. У 10 крыс на обеих задних конечностях сбривали шерсть в области проекции икроножных мышц и в течение 2 нед подвергали 10-кратному лазерному воздействию, чередуя сеансы импульсного ИК- и HeNe-лазера. На следующий день после воздействия лазерного излучения у 5 крыс взвешивали икроножные мышцы, фиксировали тимус и костный мозг (опыт-1). Другим 5 облученным животным давали физическую нагрузку (плавание в течение 30 мин при комнатной температуре) (опыт-2). В тот же день в течение первых 1 - 1,5 ч после плавания также взвешивали икроножные мышцы, фиксировали тимус и костный мозг крыс. Контроль: необлучен- ные крысы того же возраста до начала эксперимента. Условия локального воздействия импульсным ИК- лазером (5 сеансов по 3 мин): аппарат ОРИОН-8 (ВНПП «ЖИВА»), длина волны 890 нм, частота следования импульсов 1500 Гц, выходная мощность лазерного излучения 9 Вт, мощность в импульсе 6 мВт, площадь облучения 1,5 см2, плотность потока мощности 4 мВт/см2, доза за время одной 3-минутной процедуры 0,72 Дж^м2, за 5 сеансов - 3,6 Дж^м2 на каждую конечность, в сканирующем режиме. Условия локального воздействия лазерным излучением в красном диапазоне (5 сеансов по 3 мин): HeNe-лазер, установка ОКГ-12 (Россия), длина волны 632,8 нм, лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2-2,5 см, плотность мощности составляла 2,5-3 мВт/см2, доза за время одной 3-минутной процедуры 0,45-0,54 Дж^м2, за 5 сеансов 2,25-2,70 Дж/см2 на каждую конечность. В целом каждое животное после облучения обеих задних конечностей двумя видами лазерного излучения перед физической нагрузкой Оригинальные статьи Рис. 1. Тимус крысы через 1 сут после 10 сеансов облучения обеих икроножных мышц ИК- и He-Ne-лазерами (опыт-1). Уменьшение коркового слоя и расширение мозгового слоя. Увеличение количества мелких сосудов и капилляров в септах и мозговом слое. Здесь и на рис. 2 окраска железным гематоксилином по Рего и Маллори. Ув. 100. (опыт-1) и после плавания (опыт-2) получило дозу 11,70 - 12,60 Дж/см2. О влиянии исследуемых факторов на состояние икроножных мышц судили по изменению их относительной массы (% от массы тела животного). Функциональное состояние органов иммунной системы животных (тимус и костный мозг) проводили с помощью гистологических, цитологических, цитогенетических и морфометрических методов. Тимусы и большеберцовую кость голеней фиксировали в смеси Карнуа. При исследовании тимусов определяли их относительную массу (в % от массы тела животного). Готовили гистологические срезы толщиной 7-8 мкм, окрашивали их гематоксилином по Рего и по Маллори. Методом полей с помощью тестовой окулярной сетки и бинокулярной лупы МБС-1 при 25-кратном увеличении определяли количество коркового и мозгового вещества в тимусе. Для этого в 5 гистологических срезах подсчитывали количество точек в корковом и мозговом слое и выражали в % к общему количеству точек, подсчитанных по всему срезу тимуса. С целью оценки митотического индекса (МИ, в %о) тимоцитов в корковом и мозговом слое тимуса у каждого животного было подсчитано по 6000-7000 и 2000-2500 клеток соответственно. Определяли также количество лимфоидных клеток, подвергавшихся пикнозу (в %). Кроме того, в тимусе и костном мозге ана-телофазным методом определяли количество клеток с аберрантными митозами. В тимусе просматривали несколько гистологических срезов. Для анализа костного мозга из большеберцовых косточек извлекали фрагменты костного мозга и промывали в течение 1-2 мин в дистиллированной воде, переносили в краску ацетокармин и во влажной камере держали в холодильнике в течение 3-5 сут. После этого приготавливали временные препараты: небольшой кусочек ткани помещали на предметное стекло в каплю хлоралгидрата, покрывали покровным стеклом и слегка надавливали. От каждого животного анализировали по нескольку кусочков костного мозга. При определении хромосомных аберраций (ХА) учитывали не очень поздние и поздние анафазы и ранние телофазы [18]. Общее количество подсчитанных анафаз-телофаз составляло 180-200 клеток. ХА выражали в % от общего количества ана-те- лофаз. Для определения клеток с ХА учитывали митозы с мостами, фрагментами, смешанной патологией (мосты и Рис. 2. Тимус крысы после 10 сеансов облучения обеих икроножных мышц ИК- и He-Ne-лазерами и через 1-1,5 ч после плавания (опыт-2). Увеличение количества мозгового вещества, инволюция слоев, рыхлое расположение тимоцитов в корковом слое. фрагменты), а также мосты со значительно отстающими и слипшимися при расхождении хромосомами. Количественные данные обрабатывали статистически, и различия средних величин оценивали по критерию Стьюдента. Исследования выполнены с соблюдением Правил проведения работ с использованием экспериментальных животны». Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Результаты и обсуждение Масса икроножных мышц в контроле, а также на следующие сутки после завершения 10-кратного облучения мышц ИК- и He-Ne-лазерами в течение 2 нед (опыт-1) и в течение первых 1,5-2 ч после 30-минутного плавания облученных животных (опыт-2) практически не изменялась и составляла 0,54 ± 0,01, 0,54 ± 0,01 и 0,55 ± 0,01% соответственно. Очевидно, это можно объяснить сравнительно коротким периодом тестирования после воздействия изучаемых факторов. Однако при облучении обеих задних конечностей крысы ИК- и He-Ne-лазерами, которые имеют различную глубину проникновения в ткани, наблюдалась активная реакция органов иммунной системы. Изменения в тимусе и костном мозге происходили уже на ранних сроках после лазерного облучения и плавания. Оригинальные статьи Рис. 3. Варианты ХА, встречающихся в тимусе и костном мозге: нормальная анафаза (а); анафаза с мостом и фрагментом (б); анафаза с фрагментом и отставшей хромосомой (в); анафаза с отставшей хромосомой (г); анафаза со значительно отстающей хромосомой (д); анафаза с 2 мостами (е). Окраска ацетокармином. Ув. 1000. В тимусе контрольных крыс различались дольки с четкой границей между корковым и мозговым слоем. Корковое вещество занимало большую площадь по сравнению с мозговым. В целом тимоциты в корковом слое лежали плотно. В опыте-1 после завершения 10 сеансов лазерного облучения обеих икроножных мышц у крыс в дольках тимуса сохранялась четкость границ между корковым и мозговым веществом (рис. 1). Заметно снижалось количество коркового вещества и увеличивалось количество мозгового вещества. В некоторых участках тимуса отмечались более рыхлое расположение тимоцитов, частичное разрушение структуры долек, пустоты. Увеличивалось число капилляров и мелких сосудов, особенно в мозговом слое. Встречались единичные дольки, замещенные жировой тканью. Количественные данные, представленные в таблице, указывали на тенденцию к увеличению массы тимуса по сравнению с контролем. Значимо снижалось количество коркового вещества (84 ± 1% в контроле и 76 ± 1% в опыте; р < 0,01). В корковом слое на фоне достоверного уменьшения его ширины и тенденции к снижению митотической активности тимоцитов отмечалось достоверное увеличение гибели лимфоцитов (0,43 ± 0,09% в контроле и 0,92 ± 0,18% в опыте; р < 0.05). В мозговом слое достоверно увеличивалось только количество лимфоцитов с пикнозом ядер. В опыте-2 физическая нагрузка на облученных лазером крыс также вызывала заметные деструктивные изменения в тимусе. В тимусных дольках уменьшалась ширина коркового слоя за счет увеличения мозгового слоя. Во многих дольках не определялась четкость границ между корковым и мозговым веществом, наблюдалась инволюция слоев (рис. 2). В корковом веществе встречались участки с более рыхлым расположением тимоцитов, пустоты, особенно в апикальной области тимуса. Чаще обнаруживали дольки, замещенные жировой тканью. Данные, представленные в таблице, показывают, что по сравнению с контролем масса тимуса также имела тенденцию к увеличению. При этом в корковом слое уменьшались его ширина и МИ тимоцитов, а в обоих слоях тимуса увеличивалось количество лимфоидных клеток, подвергавшихся пикнозу (1,08 ± 0,16% в корковом слое и 0,74 ± 0,22% в мозговом слое), что было достоверно по сравнению с соответствующими показателями в контроле (р < 0,02 - 0,01). В тимусе также отмечалось усиление кровоснабжения, увеличение количества мелких кровеносных сосудов и образование более разветвленной сети капилляров в мозговом слое. Воздействие ИК- и He-Ne-лазеров в данной дозе и режиме облучения на икроножные мышцы крыс (опыт-1), а также физическая нагрузка на облученных животных (опыт-2) вызывали некоторые цитогенетические изменения в клетках тимуса и костного мозга (рис. 3). В клетках тимуса у контрольных крыс ХА составляли 12 ± 3%, а процентное соотношение нормальных анафаз-телофаз, анафаз-телофаз с мостами и отставшими хромосомами, фрагментами, а также смешанной патологии - 88, 7, 5 и 0 соответственно. У подопытных крыс процент ХА был практически одинаковым, но достоверно выше, чем в контрольной группе животных. Так, в опыте-1 ХА наблюдались в 25 ± 2% случаев (р < 0,01), а соотношение нормальных и аберрантных ана-телофаз составляло 75, 12, 12 и 1%. В опыте-2 количество ХА равнялись 24±2% (р < 0,01), а соотношение нормальных митозов и митозов с соответствующими нарушениями - 76, 12, 10 и 2%. В клетках костного мозга наблюдалась такая же закономерность. В контроле ХА определялись в 16 ± 2% ана-телофаз, а соотношение нормальных и аберрантных митозов - 84, 11, 5 и 0%. В опыте-1 количество ХА равнялось 30 ± 2%, что было достоверно выше, чем в контроле (р < 0,01). При этом соотношение нормальных и аберрантных митозов было 70, 18, 10 и 2%. В опыте-2 количество митозов с ХА также было достоверно выше, чем в контроле, и равнялось 28 ± 3% (р < 0,01), а соотношение нормальных митозов и митозов с соответствующими нарушениями - 72, 17, 9 и 2%. У контрольных животных в тимусе и костном мозге отмечались в основном аберрантные клетки с одним мостом или слипшимися хромосомами. У подопытных крыс преобладали митозы с 2-3 мостами, значительным отставанием хромосом, а также увеличивалось число ана-телофаз с мостами и фрагментами. Согласно современным представлениям, формиро- Оригинальные статьи Морфометрические и цитологические показатели состояния тимуса взрослых крыс Исследуемые параметры Контроль Опыт-1 (5 сеансов ИК + 5 сеансов He-Ne- лазера) Опыт-2 (5 сеансов ИК + 5 сеансов He-Ne-лазера + плавание) Масса тимуса, % к массе тела) 0,09 ± 0,010 0,12 ± 0,010 (р < 0,1)* 0,11 ± 0,006 Ширина коркового слоя, % 84 ± 1 76 ± 1 (р < 0,01)* 77 ± 2 (р < 0,01)* МИ тимоцитов в корковом слое, %о 7,08 ± 0,23 6,05 ± 0,46 4,77 ± 0,22 (р < 0,01)* (р < 0,05)** Пикноз лимфоцитов в корковом слое, % 0,43 ± 0,09 0,92 ± 0,18 (р < 0,05)* 1,08 ± 0,16 (р < 0,01)* Ширина мозгового слоя, % 16 ± 1 24 ± 1 (р < 0,01)* 23 ± 2 (р < 0,01)* МИ тимоцитов в мозговом слое, %о 2,78 ± 0,65 2,88 ± 0,20 3,66 ± 0,13 (р < 0,02)** Пикноз лимфоцитов в мозговом слое, % 0,26 ± 0,03 0,40 ± 0,02 (р < 0,01)* 0,74 ± 0,22 (р < 0,02)* (р < 0,1)** Примечание. * - достоверные различия по сравнению с контролем; ** - достоверные различия по сравнению с опытом-1. вание мостов в анафазе митоза чаще всего обусловлено нарушениями при расхождении хроматид. Мосты свидетельствуют о происшедшей делеции - выпадении участка с центромерой, а отстающие хромосомы являются результатом их повреждений в области кинетохора [19]. Данные гистологического, морфометрического, цитологического и цитогенетического анализа тимуса и костного мозга показали что облучение обеих задних конечностей крыс в области проекции икроножных мышц ИК- и He-Ne-лазерами в изученной дозе и режиме воздействия (11,70 - 12,60 Дж/см2, 10 сеансов в течение 2 нед) снижало их функциональную активность, а в сочетании с последующей физической нагрузкой подавляющий эффект усиливался. Наши наблюдения снижения функции тимуса после лазерного воздействия подтверждают результаты, полученные нами ранее при оценке реакции тимуса у предварительно облученных He-Ne-лазером крыс на имплантацию аллогенной мышечной ткани [20], и согласуются с наблюдениями других исследователей [10-13]. Увеличение количества ана-телофаз в клетках костного мозга после лазерного воздействия согласуется с данными, полученными другими исследователями при мета- фазном анализе цитогенетических нарушений в костном мозге, облученном He-Ne-лазером [16]. Возможные цитогенетические нарушения в клетках тимуса и костного мозга в условиях воздействия ИК- и He-Ne-лазеров на икроножные мышцы и при физической нагрузке на облученных в таком же режиме животных показаны нами впервые. Подобных сообщений в доступной нам литературе мы не встречали. Увеличение в обеих сериях опытов количества лимфоцитов с пикнотическими ядрами как в корковом, так и в мозговом слое тимуса может быть обусловлено повышенным количеством аберрантных митозов. Ослабление функции клеток костного мозга, усиление цитологических нарушений после лазерного облучения и физической нагрузки могут влиять на физиологическую регенерацию скелетной мышечной ткани, снижая активность восстановительных/адаптивных процессов в мышцах, в том числе у спортсменов. Как было недавно установлено, стволовые клетки костного мозга принимают участие в этом процессе, непосредственно сливаясь с мышечным волокном [21]. При сравнении данных в опыте-1 и опыте-2 следует отметить, что при физической нагрузке на облученных крыс (опыт-2) пролиферативная активность тимоцитов в корковом слое была достоверно ниже по сравнению с соответствующим показателем у крыс в опыте-1. МИ ти- моцитов в мозговом слое был высоким, но число лимфоидных клеток с пикнозом ядер имело тенденцию к увеличению. Поскольку от активности тимоцитов зависит восстановление тимуса [22], можно полагать, что сразу после физической нагрузки тимус у облученных лазером животных становится более ослабленным. Заключение Воздействие ИК- и He-Ne-лазеров в изученных дозе и режиме облучения скелетных мышц и последующая физическая нагрузка на облученный лазером организм могут снижать активность иммунной системы. В тимусе и костном мозге с помощью ана-телофазного метода впервые описан цитогенетический эффект лазерных лучей. На основании полученных результатов мы приходим к выводу о том, что в практике спортивной медицины для снижения возможных неблагоприятных последствий лазеротерапии скелетных мышц перед физической нагрузкой/тренировкой необходимо определить оптимальную дозу лазерного облучения и разработать щадящий режим лазерного воздействия, что в свою очередь может определяться исходным состоянием организма. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

Nelli V. Bulyakova

Federal state budgetary institution of science “A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution”, Russian Academy of Sciences

Email: bulyakova38@mail.ru
119071, Moscow, Russia

V. S Azarova

Federal state budgetary institution of science “A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution”, Russian Academy of Sciences

119071, Moscow, Russia

References

Supplementary files