The new possibilities for the rehabilitation of conserved erythrocytes with the use of ozone

Full Text

Несмотря на стандартизацию интенсивной терапии (International Consensus Upper Gastrointestinal Bleeding Conference Group 2010), прогресс и успехи реаниматологии, общая летальность при неязвенных желудочно-кишечных кровотечениях (НЯК) не имеет тенденции к снижению и составляет до 24% [1]. Важной составляющей коррекции патологических эффектов острой кровопотери при НЯК является восстановление глобулярного объема, а также кор - рекция ассоциированной с геморрагическим шоком эндогенной интоксикации [2-5]. Вместе с тем, применение эритроцитарной массы особенно значительных сроков хранения, приводит лишь к дополнительному сладжированию и тромбированию микроцир- куляторного русла и, вследствие этого, ухудшению газотранспортной функции крови [6, 7]. Исследования морфофункциональных характеристик консервированных эритроцитов выявили необходимость и потенциал их морфофункциональной реабилитации [8-10]. В качестве медицинской технологии, успешно применяющейся в области физиотерапии патологических состояний, сопровождающихся тканевой гипоксией, наше внимание привлекла озонотерапия [11, 12]. Продемонстрированные в многочисленных исследованиях антигипоксантные и антиоксидантные свойства озонированного 0,9% раствора NaCl (ОФР) in vivo, в том числе и на морфофункциональные свойства эритроцитов, позволили предположить высокий потенциал озона в коррекции консервационно обусловленных нарушений кислородо-транспортной функции эритроцитарной массы [11]. Цель исследования: разработать методику и изучить клиническую эффективность применения ОФР для предтрансфузионной реабилитации консервированных эритроцитов у больных с кровопотерей язвенной этиологии. Материалы и методы Объектом исследования на этапе разработки методики in vitro служила стабилизированная гемоконсервантом ЦФДА-1 в соотношении 1:4 эритроцитар- ная масса крови человека. Эритроцитарная масса хранилась при температуре 4°С - 7, 14, 21 и 30 сут. Донорскую кровь получали на станции переливания крови. В ходе озонирования эритроцитарная масса (2 мл) различных сроков хранения смешивалась с ОФР в эквивалентном объеме, содержащем различные концентрации озона. Используемые концентрации озона 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 15 мг/л. Озонирование физиологического раствора производили на установке озонаторной терапевтической автоматической УОТА-60-01-"Медозон" непосредственно перед смешиванием его с эритроцитар- ной массой. Концентрация озона в озонированном растворе измерялась путем отбора проб во встроенном в прибор измерителе концентраций. Через 1 ч экспозиции в полученной эритроцитарной взвеси определяли концентрации аденозинтрифосфата (АТФ) и 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ). Оценка результатов применения разработанной методики предтрансфузионной реабилитации консервированной эритроцитарной массы проводилась в отделении анестезиологии и реаниматологии (ОРиТ) ГКБ № 40 Нижнего Новгорода. В исследование включены 63 пациента с желудочно-кишечным кровотечением (ЖКК) в возрасте от 38 до 70 лет, госпитализированных в ОРиТ с кровопотерей тяжелой степени. Больные были разделены на 2 группы, сравнимые по физикальным, анамнестическим показателям и исходной тяжести состояния. Исследуемая группа (n = 33) состояла из пациентов, которым наряду со стандартной интенсивной терапией проводили по общепринятым показаниям однократную трансфузию эритроцитарной массы, предварительно смешанной в пропорции 1:1 с ОФР с концентрацией озона 2 мг/л. Контрольная группа (n = 30) включала пациентов, интенсивная терапия которых включала однократную трансфузию консервированной эритроцитарной массы, предварительно смешанной в пропорции 1:1 с раствором 0,9% NaCl. Сроки хранения трансфузированной эритроцитарной массы в группах были сравнимы и варьировали вплоть до 28 сут. Объем кровопотери оценивался по шоковому индексу Альговера. Исследование системной гемодинамики проводили неинвазивным способом - методом интегральной реографии тела (ИРГТ) по М.И. Тищенко с помощью компьютерного комплекса "Диамант-М" (СПб, Россия). Уровень лактата, пон Исследуемая ---------------------- Контрольная Рис. 1. Динамика концентрации 2,3 ДФГ в эритроцитах реципиента на фоне трансфузии, у.е. Здесь и на рис. 2, 3: 1 - достоверное отличие относительно исходных значений (p < 0,05); 2 - достоверное отличие от предыдущего этапа (p < 0,05); 3 - достоверное межгрупповое различие значений < 0,05). Исследуемая ---------------------------- Контрольная Рис. 2. Динамика концентрации МДА в эритроцитах реципиента на фоне трансфузии, мкмоль/л. казатели кислородтранспортной функции крови и метаболический статус определяли из проб артериальной (a. femoralis) и венозной (v. subclavia) крови газоанализатором GEM PREMIER 4000. Оценку системного влияния полученной эритроцитарной взвеси на показатели 2,3-ДФГ и АТФ в суспензии отмытых эритроцитов реципиента исследовали неэнзиматическим методом. Для оценки процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) осуществляли измерение индуцированной железом и перекисью водорода хемилюминесценции сыворотки на приборе БХЛ-06. Концентрацию продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в плазме определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой. (Конюхова В.С., 1989). Были выделены следующие этапы исследования: 1-й этап - при поступлении, 2-й - через 2 ч после трансфузии, 3-й - через 48 ч после трансфузии, 4-й - через 72 ч после трансфузии. Полученные результаты обрабатывали при помощи программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0. Различия средних величин, признавались достоверными при уровне статистической значимости р < 0,05. Результаты и их обсуждение Опубликованные раннее экспериментальные данные по исследованиям in vitro показали, что при смешивании консервированных эритроцитов и ОФР в малых концентрациях улучшается их кислород- транспортная функция, за счет как увеличения концентрации 2,3-ДФГ, так и роста содержания АТФ [13] . Наиболее оптимальной концентрацией озона в растворе, при одинаковом соотношении объема обрабатываемых эритроцитов и ОФР, является 2 мг/л. При этом соотношении в консервированных эритроцитах регистрируется рост обеих форм неорганического фосфата. Увеличение концентрации озона не приводит к повышению эффективности его действия на метаболизм, так как не всегда сопровождается достоверным увеличением и АТФ, и 2,3-ДФГ в клетках, что в свою очередь объясняется действием озона на активацию как анаэробного гликолиза, так и его бокового пути с увеличением содержания 2,3-ДФГ и требует дополнительного учета сроков хранения эритроцитарной массы. Использование эритроци- тарной массы сроком хранения более 30 сут при ее озонировании вызывает истощение энергетических ресурсов клеток. Разработанная in vitro стратегия предтрансфузи- онной реабилитации консервированных эритроцитов была применена нами при трансфузии эритро- цитарной массы у больных с ЖКК. Проведенные исследования продемонстрировали возможность опосредованного влияния обработанных ОФР эритроцитов донора на метаболизм эритроцитов реципиента даже при однократном их переливании. Так, в течение 48 ч после переливания озонированной эритроцитарной массы (ОЭМ), регистрировался значительный прирост содержания в них 2,3-ДФГ и АТФ, что в свою очередь закономерно повлияло на выраженность коррекции эритроцитассоциирован- ных нарушений системы кислородного транспорта (рис. 1). Наибольшие межгрупповые различия по концентрации 2,3-ДФГ регистрировались в течение первых суток после гемотрансфузии обработанной озоном эритроцитарной массы, составляя в среднем 32,5%. Улучшение энергетической обеспеченности кислородного транспорта в исследуемой группе было стойким и сохранялось вплоть до 72 ч после трансфузии, превышая аналогичный показатель в контрольной группе в среднем на 19,4%. Указанные эффекты были получены исследователями ранее на клинической модели большой аутогемотерапии с озоном и объясняются возможностью опосредованного стимулирующего влияния на метаболизм эритроцита продуктов распада озона - озонидов, а также стимулированной секреции клетками крови других биологически активных веществ [11]. Значимая антиоксидантная активность ОЭМ была выявлена при исследовании динамики показателей ПОЛ и антиоксидантной активности (АОА) как в плазме, так и в эритроцитах пациентов (рис. 2). В обеих группах больных исходный уровень ПОЛ был повышен. Так, концентрация МДА в циркулирующих эритроцитах составляла в среднем в контрольной группе 3,0 ± 0,44 мкмоль/л, а в исследуемой - 3,1 ± 0,48 мкмоль/л. На фоне назначенной интенсивной терапии, коррекции шоковых явлений, улучшения процессов тканевого метаболизма в обеих группах отмечено значимое уменьшение показателя Imax, а также концентрации МДА, что свидетельствовало о сокращении концентрации липопероксидов в крови и снижении интенсивности свободнорадикального окисления. Вместе с тем, непосредственно после проведения стандартной трансфузии нами был зафиксирован рост исходно повышенного Imax у пациентов контрольной группы с 29,9 ± 0,27 у. е. до 31,3 ± 0,36 у. е., что демонстрировало пагубное влияние трансфузии эритроцитарной массы, особенно длительных сроков хранения, на выраженность эндотоксикоза у больных с геморрагическим шоком, в том числе и за счет увеличения прооксидантного органоповреждающего потенциала. Тогда как применение ОЭМ с первых суток корригировало ПОЛ - в частности снижало исходно повышенный уровень Imax с 30,4 ± 0,49 до 28,3 ± 0,19 у. е. В дальнейшем указанные изменения становились более значимыми, что свидетельствовало о стойком антиоксидантном эффекте даже однократной трансфузии ОЭМ в рекомендованной дозировке у больных с ЖКК вплоть до 3-х суток терапии, когда межгрупповая разница по данному показателю составляла в среднем 36,8%. С другой стороны, применение ОЭМ сопровождалось более ускоренным (p < 0,05) восстановлением уровня АОА, что выражалось в значимом межгруп- повом и межэтапном росте исходно сниженных показателей начиная со 2-х суток интенсивной терапии. Так межгрупповые различия по указанным показателям через 48 и 72 ч после гемотрансфузии составили в среднем по S (светосумма) 41,6 и 28,3%, а по Tga - 15,5 и 18,1% соответственно. Необходимо отметить, что выраженные антиоксидантные свойства озона in vivo, продемонстрированные исследователями раннее, эффективно реализуются в организме при использовании данной методики опосредовано, через однократно обработанные консервированные эритроциты [11, 12]. При предложенной схеме их обработки АОА сохраняется значительное время, что является немаловажным при клинически обоснованной однократной гемотрансфузии. Применение ОЭМ у больных исследуемой группы привело к более быстрой и стойкой по сравнению со стандартной гемотрансфузией нормализации скомпрометированной тяжелой кровопотерей систолической функции левого желудочка уже на 3-и сутки интенсивной терапии. Это подтверждается динамикой показателей скоростных и объемных параметров кровотока. В частности, исходно регистрирующееся на фоне гемотрансфузии незначительное снижение сердечного индекса (СИ) в исследуемой группе с 2,7 ± 0,37 л/минм2 до 2,5 ± 0,24 л/минм2 непосредственно после гемотрансфузии сменяется устойчивым ростом показателя через 48 и 72 ч терапии 20,1 и 31,3% соответственно. В контрольной группе, напротив, тенденция к снижению СИ после тяжелой кровопотери сохранялась вплоть до 3-х суток интенсивной терапии, при этом снижение данного показателя к 3-м суткам достигало 1,8 ± 0,17 л/мин м2, отражая выраженность гипоксического постгеморрагического повреждения миокарда. О необходимости, а также эффективности антигипок- сантной коррекции нарушенного гипоксией метаболизма говорят значения межгрупповой разницы по СИ в данный период, достигающие в среднем 35,8%. Уже со 2-х суток лечения в исследуемой группе увеличивался минутный объем кровообращения (МОК) в среднем на 17,5%, прежде всего за счет увеличения на фоне применения ОЭМ фракции выброса (ФВ). Исходно, доставка кислорода в представленных группах была снижена относительно должных величин, прежде всего за счет гемодинамических и гемических причин, вызванных состоявшейся кро- вопотерей, и составляла 253,9 ± 24,33 мл/минм2 и 243.6 ± 23,98 мл/минм2 в контрольной и исследуемой группах соответственно. В этой ситуации в группах отмечалось компенсаторное увеличение потребления кислорода, превышающее должные показатели в среднем на 27,1%, с повышением коэффициента утилизации (КУО2) до 37,6%. Значимое изменение комплекса показателей кислородотранспортной функции крови у исследованных больных отмечено с 2-3-х суток проводимой терапии, что высоко коррелировало с динамикой показателей ПОЛ-АОА и концентрацией эритроцитарных макроэргов. Так, показатель доставки кислорода в исследуемой группе на 2-е сутки терапии превышал аналогичный контрольный показатель в среднем на 26,7%, а к 3-м суткам возрос до 293,3 ± 23,98 мл/минм2, превысив тем самым исходные значения в среднем на 17,1%. Необходимо подчеркнуть, что стандартная гемотрансфузия в то же время не приводила к ожидаемому росту доставки кислорода тканям, а, напротив, усугубляла ее снижение, составив в среднем к 3-м суткам терапии 143.7 ± 20,18 мл/мин-м2, межгрупповые различия на данном этапе составили в среднем 48,9% (рис. 3). Увеличение доставки кислорода в раннем после шоковом периоде обусловлено компенсаторной реакцией на транзиторный гипоксический эпизод, ассоциированный с кровопотерей. Большая выраженность этой реакции у больных, получавших ОЭМ, прежде всего за счет оптимизации энергетических процессов как в трансфузируемых, так и в эритроцитах пациента, а также коррекции процессов ПОЛ и АОА, позитивно отразилась на динамике такого важного показателя выраженности тканевой гипоксии, как лактат сыворотки. Существенного и стойкого снижения исходно повышенного уровня лактата до 4,1 ± 0,56 ммоль/л в исследуемой группе удалось добиться уже через сутки проводимой интенсивной терапии, в среднем до 1,3 ± 0,3 ммоль/л. Тогда как, в указанный период, на фоне стандартной гемо- 1,2,3 1,2,3 1,2,3 350 300250200150 - 100 - 2-е сутки 3-е сутки Контрольная Исходно 1-е сутки Исследуемая Рис. 3. Динамика показателя доставки кислорода на фоне трансфузии, мл/мин-м2. трансфузии, наблюдался рост данного показателя в среднем до 5,0 ± 0,47 ммоль/л, а дальнейшее его снижение было существенно замедленно и достигало нормальных величин лишь к 3-м суткам интенсивной терапии (1,6 ± 0,26 ммоль/л). Озонированная гемотрансфузия удовлетворительно переносится больными НЯК и тяжелой степенью кровопотери. Реакций, осложнений и побочных эффектов при использовании озонированной эритроцитарной массы во время и после трансфузии не отмечалось. При включении в интенсивную терапию ОЭМ достоверно сокращалось время пребывания пациентов в ОРИТ с 4,9 до 3,6 сут, уменьшалась частота развития синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) с 33,9 до 21,1%. Вывод. Сравнение результатов трансфузионной терапии по предложенной методике с традиционным подходом показало, что предварительная обработка озоном позволяет достоверно более выражено снизить степень проявлений тканевой гипоксии и улучшить процессы доставки, потребления и утилизации кислорода. Применение озонированной эритроцитарной массы повышает активность анти- оксидантной системы, оказывает антигипоксантное действие, способствует снижению интенсивности процессов ПОЛ.

About the authors

Ionas S. Simutis

Nizni Novgorod regional state budgetary healthcare facility “City Clinical Hospital No 40”

Email: simutis@mail.ru
Nizhni Novgorod, 603016

G. A Boyarinov

State educational institution of higher professional education “Nizhni Novgorod State Medical Academy”

Nizhni Novgorod, 603016

A. S Mukhin

State educational institution of higher professional education “Nizhni Novgorod State Medical Academy”

Nizhni Novgorod, 603016

D. B Prilukov

Federal state healthcare facility “Privolzhsky District Medical Centre”, Russian Federal Medico-Biological Agency

Novgorod, 603016

A. V Deryugina

State educational institution of higher professional education “N.I. Lobachevsky Nizni Novgorod State University”

Novgorod, Russia, 603016

References

Supplementary files