The influence of laser irradiation on regeneration of skeletal muscles after their mechanical injury of various intensity (an experimental study)

Full Text

С целью улучшения восстановительных процессов в травмированных тканях широко применяются методы квантовой медицины, в частности лазерное излучение низкой интенсивности [1]. Поиск условий лазерного воздействия, при которых возможно максимальное восстановление структуры и функции поврежденных скелетных мышц, до сих пор остается одной из актуальных проблем в биологии и медицине. После воздействия лазерного излучения на поврежденную мышечную ткань отмечаются снижение перекисного окисления липидов, уменьшение апо-птоза мышечных клеток и деструктивных процес- Нелли Васильевна Булякова, e-mail: bulyakova38@mail.ru сов, сокращение течения воспалительного процесса, активация "дремлющих" мышечных клеток-сателлитов, повышение их пролиферативной активности и обменных процессов, стимуляция микроциркуляции и восстановления нервно-мышечных контактов [2-9]. Положительный эффект лазерного излучения на восстановление скелетных мышц как сократительного органа описан при незначительных разрушениях целостности мышц и различных режимах лазерного облучения [10-14]. га Однако, как известно, успех регенерационного процесса в травмированных скелетных мышцах зависит от интенсивности повреждения скелетных мышц [15-17]. Кроме того, лазеротерапия тканей и органов непосредственно в области патологии оказывает влияние на функционально связанные с ней системы организма, в частности иммунную систему. Активация иммунной системы влияет на регенеративные процессы в органах и тканях [18]. Воздействие лазерного излучения может вызывать как стимулирующее, так и угнетающее действие на органы иммунной системы [19-22]. Нами ранее было показано, что положительный эффект лазеротерапии регенерирующих необлученных и облученных (20 Гр) скелетных мышц может сопровождаться длительным сохранением повышенной функциональной нагрузки на тимус [23]. Целью данной работы явилось проведение сравнительного исследования эффективности импульсного высокочастотного инфракрасного лазерного излучения на восстановление скелетных мышц в зависимости от степени их повреждения, а также необходимость оценки динамики показателей массы тела и функционального состояния тимуса как главного органа иммунной системы у молодых и взрослых крыс. Материалы и методы Эксперимент проведен на 32 беспородных крысах-сам-цах двух возрастных групп: активно растущих животных в возрасте 1,2-1,5 мес массой тела 115-130 г (1-я серия) и взрослых крыс в возрасте 10-11 мес массой тела 390-450 г (2-я серия). В каждой возрастной группе регенерация мышц была исследована при двух видах травмы: аутотрансплантация in situ измельченной или целой икроножной мышцы. В первом случае полное разрушение структуры обеих икроножных мышц крысы (мышечные фрагменты составляли 2-3 мм) и последующая аутотрансплантация только половины мышечной массы. Во втором случае структура икроножных мышц крысы не нарушалась. Перерезали только проксимальное и дистальное сухожилия, а также большеберцовый нерв, входящий в мышцу. При этом наблюдали нарушение кровоснабжения. Мышцу не подшивали. Крысам контрольной группы после обоих видов травмы икроножных мышц лазеротерапию не проводили. Животным опытной группы после такой же травмы каждую оперированную голень в центральной части облучали инфракрасным лазером (метод контактный, стабильный) на 2, 3, 5, 7 и 9-й дни суммарно в дозе 1,2 Дж/cм2 (по 1 мин на каждую конечность). Животных оперировали под нембуталовым наркозом. После операции на икроножных мышцах кроющую мышцу и кожу зашивали послойно хирургическим шелком. Лазеротерапию осуществляли с помощью аппарата ОРИОН-8 (ВНПП "ЖИВА"), Параметры воздействия импульсным инфракрасным лазером: длина волны 890 нм, частота следования импульсов 1500 Гц, мощность в импульсе 9 Вт, площадь облучения 1,5 см2, плотность энергии за время одной процедуры 0,24 ДжАм2. Исследования выполнены с соблюдением "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных". Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Мышечные регенераты и тимусы изучали с помощью гистологических, цитологических и морфометрических методов через 30 сут после операции, когда уже можно судить о тенденции регенерационного процесса. Исследуемые органы фиксировали в смеси Карнуа, срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали железным гематоксилином по Рего с докраской по Маллори. Определяли относительную массу восстановленных мышц (процент от массы тела). Для определения количества мышечной и соединительной ткани в регенератах измеряли площадь, занимаемую этими тканями на трех гистологических срезах, проходящих на разных уровнях регенерата, и выражали ее в процентах от площади гистологического среза. В Для анализа функциональной активности регенератов их вырезали и сразу же определяли способность к сокращению при раздражении электрическим током (аппарат ЭСЛ-2, Россия) большеберцового нерва или при прямом воздействии на регенерат. Это позволяло оценить степень восстановления сократительной функции: возможность проведения импульса через нерв или только формирование функционально активных нервно-мышечных контактов [15]. Анализировали динамику изменения массы тела животных после завершения лазеротерапии травмированных мышц (на 10-е сутки) и к концу эксперимента (на 30-е сутки после травмы). Измеряли величину относительной массы тимуса (процент от массы тела). Используя так называемый метод полей с помощью тестовой окулярной сетки и бинокулярной лупы МБС-1 при увеличении в 25 раз в пяти гистологических срезах, подсчитывали количество точек в корковом и мозговом слоях и выражали в проценте от общего количества точек, подсчитанных по всему срезу тимуса. Для определения митотического индекса тимоцитов у каждого животного в корковом слое тимуса было просчитано по 6000-7000 клеток. Количественные данные обрабатывали статистически и различия средних величин оценивали по критерию Стьюдента. Результаты и обсуждение Аутотрансплантированная измельченная мышечная ткань регенерирует, и на 30-е сутки в ложе удаленной мышцы у молодых и взрослых крыс как в контроле, так и в опыте образуется мышечно-соединительнотканный орган, структура которого значительно отличается от мышцы до операции. Образования латеральной и медиальной головок не происходило. В ложе удаленной мышцы наблюдались тяжи коллагеновых волокон с многочисленными активно делящимися фибробластами. Тяжи располагались продольно и формировали подобие каркаса. Между ними видны пучки узких регенерирующих поперечно полосатых мышечных волокон (рис. 1, а). После лазеротерапии участки регенерирующей мышечной ткани встречались по всей длине регенератов, в то время как в контрольных регенератах - преимущественно в проксимальной области. С проксимального края отмечалась короткая мышечная культя (1-1,5 мм), которая всегда остается при извлечении икроножной мышцы в момент операции. У молодых крыс в не леченных и леченных лазером 30-суточных регенератах она хорошо сохранялась и по краю можно наблюдать небольшое отрастание мышечных волокон. У взрослых крыс к этому сроку регенерации также отмечался некоторый рост мышечных волокон по краю короткой проксимальной культи, но после воздействия лазера в ней половина и более мышечной ткани подвергалось склеротизации и жировому перерождению. В условиях аутотрансплантации целой мышцы процесс восстановления был более полным. В 30-суточных регенератах различались латеральная и медиальная головки икроножной мышцы. Наряду с некоторым увеличением количества соединительной ткани в структуре регенератов, расширением септ и гиперемией крупных Регенераты икроножных мышц через 30 сут. а - мышечные волокна, регенерировавшие из измельченной мышечной ткани, повышенное содержание соединительной ткани в регенерате; б - мышечные волокна, регенерировавшие из трансплантированной целой мышцы, более упорядоченное расположение мышечных волокон, в центре септа между латеральной и медиальной головками икроножной мышцы. Окраска железным гематоксилином по Рего и Маллори. х 40. кровеносных сосудов отмечалось упорядоченное расположение регенерировавших дифференцированных мышечных волокон (см. рис. 1, б). У молодых крыс относительная масса аутотрансплантатов измельченных и целых мышц в опыте не отличалась от соответствующих показателей в контроле. Однако в опыте наблюдалась тенденция к увеличению количества мышечной ткани в них. В регенерирующих после измельчения мышцах содержалось в контроле 31±1% мышечной ткани, в опыте 33±1%. В аутотрансплантатах целых мышц - 63±1 и 68±2% соответственно. У взрослых крыс эффект лазеротерапии был неоднозначным. В условиях аутотрансплантации измельченных икроножных мышц после лазеротерапии масса мышечных регенератов была выше, чем в контроле (0,12±0,01 и 0,07±0,009% соответственно; p < 0,01), но количество мышечной ткани снижалось (34±3% в контроле и 27±3% в опыте), т. е. увеличение массы происходило за счет соединительной ткани. При лазеротерапии аутотрансплантатов целой мышцы взрослых крыс относительная масса регенератов практически не изменялась по сравнению с контролем (увеличение на 2-3%), но при этом содержалось больше мышечной ткани (65±2% в контроле и 73±3% в опыте). Лазеротерапия стимулировала восстановление сократительной функции в регенерирующей мышечной ткани. Реиннервация мышц, восстанавливающихся из аутотрансплантированных целых мышц, происходила значительно быстрее и более полно, и на 30-е сутки у молодых и взрослых крыс регенераты уже в 100% случаев активно сокращались при стимуляции большеберцового нерва электрическим током. При аутотрансплантации измельченной мышцы у молодых крыс в контроле только 25% регенератов сокращались по всей длине при стимуляции нерва. В остальных (75%) случаях сокращения при раздражении нерва или воздействии непосредственно на регенерат наблюдались только по проксимальному краю мышцы, что может соответствовать сокращению небольшой проксимальной культи, оставшейся при операции. В опыте у животных этого возраста сокращения по проксимальному краю регенерата наблюдались в 33% случаев, а в 67% случаев сокращения при стимуляции нерва и прямом воздействии на мышцу отмечались уже по всему регенерату. У взрослых крыс сокращения по всей длине регенерата при стимуляции через нерв наблюдались в контроле в 50% случаев, по проксимальному краю регенератов - в 16% случаев, а 34% регенератов не отвечали сокращением ни при раздражении нерва, ни при прямом раздражении мышцы. После лазеротерапии иннервация регенератов у взрослых крыс улучшалась. Несмотря на сравнительно небольшое количество регенерировавшей после измельчения мышечной ткани сокращения по всему регенерату наблюдались не только при стимуляции через нерв (50%), но и при прямом раздражении мышц (33%). Количество регенератов, не способных к сокращению, уменьшилось в 2 раза (17%). У молодых и взрослых животных при обоих видах травмы воздействие лазерного излучения способствовало снижению массы тела в той или иной степени, что отмечалось к моменту завершения лазеротерапии (на 10-е сутки). В дальнейшем масса тела постепенно увеличивалась. У молодых крыс снижение массы тела было выражено в меньшей степени, чем у взрослых, а к концу наблюдения (30-е сутки) отмечалась даже некоторая стимуляция роста: увеличение массы тела в 1,3 раза при аутотрансплантации измельченной мышцы и в 1,4 раза при трансплантации целой мышцы. Наблюдались различия в функциональном состоянии тимуса. Данные гистологического, морфометрического и цитологического анализа показали, что к концу срока наблюдения (30 сут) у молодых крыс в опыте и контроле при обоих видах травмы достоверных различий в величине относительной массы тимуса не выявлено (в среднем 0,18±0,03 и 0,20±0,03% соответственно). Тимус был крупный. В подавляющем большинстве долек наблюдались четкие границы между корковым и мозговым слоями. Доля н коркового вещества у исследуемых молодых животных составляла в контрольной группе 84±1% после измельчения и 82±1% после аутотрансплантации целой мышцы, в основной группе - 86±2 и 81±1% соответственно. Лимфоидные клетки в корковом слое располагались плотно. И только после лазеротерапии измельченных икроножных мышц в корковом веществе тимуса иногда наблюдалась аплазия (места за-пустений, без лимфоцитов), а митотический индекс тимоцитов снижался до 9,33±0,37%о, в то время как в контроле он был равен 16,95±2,01%о (p < 0,01). У взрослых крыс в контроле и опыте при обоих видах травмы относительная масса тимуса также не различалась и находилась в пределах 0,03-0,04%. Тимус и тимусные дольки были мельче, чем у молодых животных. Между дольками видны более широкие прослойки соединительной ткани с крупными сосудами. Встречались нарушения четкости границ между корковым и мозговым веществом, иногда инверсия слоев. Лимфоидные клетки в корковом слое расположены более рыхло. Наблюдалась аплазия органа. Количество коркового вещества составляло в контроле 65±2% после измельчения мышц и 71±1% после трансплантации целой мышцы, в опыте -67±2 и 72±3% соответственно. Пролиферативная активность лимфоидных клеток в корковом веществе после лазеротерапии измельченных мышц увеличивалась до 8,11±0,58%о, что достоверно (p < 0,01) превышало результаты в контрольной группе -5,66±0,69%о. Следует отметить, что после лазеротерапии целых мышц митотический индекс снижался более существенно (до 7,33±0,50%о; p < 0,01) по сравнению с группой контроля (10,73±0,13%о). Влияние лазеротерапии на посттравматическую регенерацию скелетных мышц было изучено в условиях повреждения различной степени тяжести: при аутотрансплантации in situ целой икроножной мышцы (с неповрежденной структурой) и после крайне тяжелой мышечной травмы (полное измельчение мышцы и аутотрансплантация in situ только половины мышечной массы). При аутотрансплантации целой мышцы количество мышечной ткани в регенератах и их сократительная активность были выше, чем при трансплантации измельченной мышцы. Наблюдаемые различия, прежде всего, объясняются особенностями регенерации мышц в этих условиях травмы. Как было установлено ранее [15, 16], при аутотрансплантации целой мышцы часть мышечной ткани на периферии мышцы может переживать состояние ишемии и сохранять свою жизнеспособность. Функционально активные нервно-мышечные контакты формируются как заново, так и в местах старых нервно-мышечных бляшек. Микроциркуляторная функция может также формироваться заново и быть восстановлена в некоторых старых участках капиллярной сети. При аутотрансплантации измельченной мышцы полностью разрушается ее соединительнотканная основа, представленная эпимизием, перимизием и эндомизием. Формирование мышечных волокон, их реваскуляри-зация и реиннервация происходят заново. Эффективность лазеротерапии также определялась степенью повреждения скелетных мышц. В аутотрансплантатах целой икроножной мышцы у молодых и взрослых крыс отмечалась тенденция к увеличению содержания мышечной ткани по сравнению с контролем. После проведенной лазеротерапии измельченных мышц у молодых крыс увеличение содержания мышечной ткани в регенератах статистически достоверно не изменялось, а у взрослых животных даже несколько (на 7%) снижалось. Однако даже после крайне тяжелой травмы мышцы, вызванной полным разрушением ее целостности, излучение инфракрасного лазера стимулировало иннервацию регенерирующей измельченной мышечной ткани и способствовало восстановлению мышцы как сократительного органа. У молодых и взрослых крыс существенно увеличивалось количество регенератов, сокращающихся по всей длине как при стимуляции через большеберцовый нерв, так и при прямом воздействии на мышцы. Последнее свидетельствует о формировании в регенерирующей ткани нервно-мышечных контактов, уже готовых к проведению нервного импульса [15]. Сокращение по всей длине регенерата топографически совпадало с расположением регенерирующей мышечной ткани. Стимулирующий эффект лазерного излучения на регенерацию периферических аксонов и восстановление сократительной функции мышц ранее был описан в литературе [24, 25]. Сила сокращения 30-суточных регенератов, восстановленных из измельченной мышцы, была сравнительно слабой как у молодых, так и у взрослых крыс. Однако функцию восстановленных после травмы мышц можно улучшить. Из многочисленных клинических исследований известно, что для улучшения сократительной активности восстановленных после травмы мышц необходима дальнейшая разработка их функции, например методами физиотерапии и лечебной физкультуры. Данных о восстановлении функции поврежденных мышц с помощью импульсного инфракрасного лазерного излучения (890 нм) при относительно низком содержании регенерирующей мышечной ткани в доступной литературе не встречалось. Ранее подобный эффект был описан нами при воздействии излучения He-Ne лазера (632,8 нм) на аутотрансплантированные измельченные икроножные мышцы новорожденных и старых крыс [26]. Вместе с тем лазеротерапия травмированных скелетных мышц оказывала влияние на гомеостаз, структурно-функциональную стабильность организма. В проведенном нами экспериментальном исследовании к моменту завершения курсового воздействия лазеротерапии у молодых и взрослых крыс при обоих видах травмы наблюдалось в той или иной степени временное снижение массы тела. По-видимому, в этот период происходит наложение эффекта от хирургического стресса и от действия лазерного излучения как внешнего фактора. После окончания курса лазеротерапии масса тела животных постепенно увеличивалась, наиболее интенсивно у молодых крыс. В то же время следует отметить сохранение реактивных изменений в структуре тимуса, а также достоверное повышение или снижение митотического индекса в лимфоидных клетках тимуса, что свидетельствует о миграции тимоцитов в область травмы облученных лазером мышц [18]. Заключение Результаты исследования показали, что с помощью лазеротерапии можно улучшить морфофункциональные параметры регенерирующих мышц даже после крайне тяжелой мышечной травмы, вызванной полным разрушением ее целостности (измельчение) и потерей половины мышечной массы. Несмотря на сравнительно небольшое количество мышечной ткани в регенератах измельченной мышцы, лазерное воздействие способствовало улучшению их функции. У молодых крыс положительный эффект был выше, чем у взрослых. Наблюдаемое снижение массы тела животных к моменту завершения лазеротерапии травмированных мышц было временным, и в дальнейшем у всех животных при обоих видах травмы наблюдалось постепенное наращивание массы тела, а в тимусе сохранялись реактивные изменения.

About the authors

N. V Bulyakova

Federal state budgetary institution of science “A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution”

Email: bulyakova38@mail.ru

V. S Azarova

Federal state budgetary institution of science “A.N. Severtsov Institute of Problems of Ecology and Evolution”

References

Supplementary files