Определение полиморфизма G/C в позиции хр20:37352001 в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) заключается в замене одного нуклеотида на другой, что часто приводит к возникновению (или исчезновению) сайта узнавания определенной рестриктазы. В результате при амплификации фрагмента ДНК с праймеров, окружающих точку SNP (содержащую либо N1, либо N2-нуклеотид), и последующего гидролиза ампликона данной рестриктазой картины расщепления ДНК будут разные для трех возможных вариантов в диплоидной ДНК (генотипы N1/N1, N1/N2 и N2/N2). Данный метод определения полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) широко используется в практике генетических исследований. Ранее мы разработали методы GlaI- и FatI-ПЦР анализа, в которых проводится ПЦР в реальном времени вместо электрофореза, и показали его применимость для определения SNP T/C. В настоящей работе предложен новый способ определения однонуклеотидного полиморфизма G/C методом Bst2UI-ПЦР анализа. GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализ использовали для определения частоты вариантов полиморфизма G/C в положении хр20:37352001 (по геномной сборке GRCh38.p14) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 161 человека. Исследование включало: 1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови; 2) проведение GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр20:37351957–37352083; 3) определение цитозина и гуанина в позиции хр20:37352001 в анализируемых препаратах ДНК; 4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 68 доноров (42.2%) имеют гетерозиготный набор G/C в положении хр20:37352001, 89 доноров (55.3%) гомозиготны по G, а четыре донора (2.5%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена G на C встречается в 76 из 322 проанализированных вариантов (23.6%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин, комплементарный G в положении хр20:37352001, в большей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин) как у гомо-, так и у гетерозигот. Предложенный метод Bst2UI-ПЦР анализа расширяет возможности определения SNP с помощью ПЦР в реальном времени.