Исследование функциональной роли консервативной последовательности на 5'-конце четвертого интрона гена mod(mdg4) в транс-сплайсинге у Drosophila melanogaster

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Альтернативный сплайсинг представляет собой важный механизм, обеспечивающий генетическое разнообразие белков. У Drosophila melanogaster были обнаружены уникальные локусы, где разнообразие мРНК возникает в результате транс-сплайсинга — процесса, при котором экзоны из различных пре-мРНК соединяются. Наиболее подробно исследован транс-сплайсинг в локусе mod(mdg4), который кодирует более 31 изоформы. Важными элементами для этого процесса являются ранее описанные консервативные последовательности в четвертом интроне. Целью данного исследования является дальнейшая характеристика консервативных мотивов четвертого интрона, а именно элемента на 5'-конце интрона. С помощью модельных трансгенных линий показано, что внесенные замены в последовательность изучаемого элемента приводят к нарушению транс-сплайсинга. Напротив, аналогичные изменения в эндогенном локусе не привели к нарушению транс-сплайсинга. Таким образом, консервативный элемент играет роль в транс-сплайсинге, но не является ключевым.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. В. Солдатова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Автор, ответственный за переписку.
Email: me@mtih.me
Россия, Москва

О. Бегинязова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me
Россия, Москва

П. Г. Георгиев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me

академик РАН

Россия, Москва

М. В. Тихонов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me
Россия, Москва

Список литературы

  1. Wright C.J., Smith C.W.J., Jiggins C.D. Alternative splicing as a source of phenotypic diversity. // Nat Rev Genet, 2022, № 23(11): P. 697–710.
  2. Labrador M., Mongelard F., Plata-Rengifo P., et al. Protein encoding by both DNA strands. // Nature, 2001, № 409(6823): P. 1000.
  3. Horiuchi T., Giniger E., Aigaki T. Alternative trans-splicing of constant and variable exons of a Drosophila axon guidance gene, lola. // Genes Dev, 2003, № 17(20): P. 2496–501.
  4. Shi X., Singh S., Lin E., et al. Chimeric RNAs in cancer. // Adv Clin Chem, 2021, № 100: P. 1–35.
  5. Tikhonov M., Utkina M., Maksimenko O., et al. Conserved sequences in the Drosophila mod(mdg4) intron promote poly(A)-independent transcription termination and trans-splicing. // Nucleic Acids Res, 2018, № 46(20): P. 10608–10618.
  6. Gao J.L., Fan Y.J., Wang X.Y., et al. A conserved intronic U1 snRNP-binding sequence promotes trans-splicing in Drosophila. // Genes Dev, 2015, № 29(7): P. 760–71.
  7. McManus C.J., Duff M.O., Eipper-Mains J., et al. Global analysis of trans-splicing in Drosophila. // Proc Natl Acad Sci USA, 2010, № 107(29): P. 12975–9.
  8. Bonchuk A.N., Balagurov K.I., Baradaran R., et al. The Arthropoda-specific Tramtrack group BTB protein domains use previously unknown interface to form hexamers. // Elife, 2024, № 13.
  9. Melnikova L., Kostyuchenko M., Molodina V., et al. Multiple interactions are involved in a highly specific association of the Mod(mdg4)-67.2 isoform with the Su(Hw) sites in Drosophila. // Open Biol, 2017, № 7(10).
  10. Soldatova Iu., Shepelev M., Georgiev P., et al. A Novel Mechanism for Transcription Termination in the mod(mdg4) Locus of Drosophila melanogaster. // Biology (Basel), 2024 in press.
  11. Kaida D., Berg M.G., Younis I., et al. U1 snRNP protects pre-mRNAs from premature cleavage and polyadenylation. // Nature, 2010, № 468(7324): P. 664–8.
  12. Tikhonov M., Georgiev P., Maksimenko O. Competition within Introns: Splicing Wins over Polyadenylation via a General Mechanism. // Acta Naturae, 2013, № 5(4): P. 52–61.
  13. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. // Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, № 104(9): P. 3312–7.
  14. Hernandez G., Vazquez-Pianzola P., Sierra J.M., et al. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. // RNA, 2004, № 10(11): P. 1783-–97.
  15. Zhang X., Koolhaas W.H., Schnorrer F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. // G3 (Bethesda), 2014, № 4(12): P. 2409–18.
  16. Ozturk-Colak A., Marygold S.J., Antonazzo G., et al. FlyBase: updates to the Drosophila genes and genomes database. // Genetics, 2024, № 227(1).
  17. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., et al. WebLogo: a sequence logo generator. // Genome Res, 2004, № 14(6): P. 1188–90.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. (А) Структура локуса mod(mdg4) у Drosophila melanogaster. Аннотированные промоторы обозначены стрелками. Общие экзоны, присутствующие во всех изоформах, показаны зеленым цветом. Донорный сплайс-сайт, участвующий в транс-сплайсинге, располагается после 4 общего экзона (обозначен красным полукругом). Альтернативные экзоны, уникальные для конкретной изоформы, отображены оранжевым цветом (на одной и той же цепи ДНК) и фиолетовым цветом (на противоположной цепи). (Б) Выравнивание 5'-сплайс-сайта четвертого интрона и прилегающих к нему последовательностей с гомологичными участками других видов. Представлены последовательности семейства Drosophilidae и мух Musca_domestica, Glossina morsitans. (В) Лого представление мотива 5'СС всех интронов Drosophila melanogaster, полученный для актуальной аннотации генома D. melanogaster [16] и визуализированный с помощью WebLogo [17]. (Г) Изменения, внесенные в последовательность на 5'-конце интрона.

Скачать (162KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (A) Схема модельной системы, предназначенной для исследования функциональной роли консервативного участка на 5'-конце интрона-4 гена mod(mdg4). “Донорная конструкция” (слева) включает промотор mod(mdg4) (обозначен стрелкой), кодирующую областью, состоящую из четырех общих экзонов (зеленые прямоугольники), IRES и интрон 4 (5'СС – красный полукруг, транскрибируемая часть интрона – красный градиент). “Акцепторная конструкция” (справа) содержит двунаправленный промотор изоформ Т и K (обозначены стрелками) и аутроны (серый) с 3’CC (красный полукруг) соответствующих изоформ. В результате транскрипции образуется донорный и два варианта акцепторных транскриптов. При транс-сплайсинге формируется два вида мРНК, состоящих из 5'-части донорного транскрипта и 3’-части акцепторных. Места отжига праймеров для анализа эффективности транс-сплайсинга обозначены стрелками под соответствующими транскриптами. (Б) Оценка эффективности транс-сплайсинга у гетерозигот донор/акцептор была проведена с помощью ОТ-кПЦР. Эффективность транс-сплайсинга оценивалась по соотношению количеств ампликонов из области соединения четвертого экзона и маркерного гена к двум генам домашнего хозяйства (Vha100-1, CG9067). Каждая комбинация трансгетерозигот была проанализирована не менее чем в трех повторностях. Планки погрешности отображают стандартные отклонения (n =3). Звездочки обозначают уровни значимости: ***P < 0.001.

Скачать (67KB)
Метаданные
4. Рис. 3. (А) Схема внесения изменений в эндогенный локус mod(mdg4). С помощью CRISPR/Cas9 вносится разрез в интроне-4 (пиктограмма ножницы). В качестве матрицы для рекомбинации использовали вектор с мутацией в одном из плечей (изменения в последовательности обозначены красным шрифтом). Для отбора трансформантов конструкция содержала флуоресцентный маркер mCherry, окруженный loxP-сайтами, благодаря которым этот ген удалялся Cre-рекомбиназой. Наблюдались два типа трансформантов – с мутацией (мутация-loxP) или с последовательностью дикого типа (wt-loxP). (Б) Оценка эффективности транс-сплайсинга у мух дикого типа и у гомозиготных линий с loxP-сайтом и с мутантным вариантом 5'-последовательности и loxP-сайтом. Эффективность транс-сплайсинга оценивалась по соотношению количеств ампликонов из области соединения четвертого экзона и альтернативных экзонов T, K, Z к двум генам домашнего хозяйства (Vha100-1, CG9067). Измерения для каждой линии были повторены не менее трех раз. Планки погрешности отображают стандартные отклонения (n =3).

Скачать (70KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025