The application of photoinactivation of Proopiobacterium acnes by laser radiation in the violet through red wavelength range for the treatment of acne

Full Text

Угревая сыпь, или акне, - хроническое, рецидивирующее, многофакторное, воспалительное заболевание сально-волосяных фолликулов, занимающее одно из первых мест в структуре дерматологической патологии среди лиц юношеского и подросткового возраста [1]. Обычно акне приобретает рецидивирующее течение и сопутствует значительному периоду жизни человека. У большей части пациентов отмечаются среднетяжелые и тяжелые формы заболевания - пустулезные, конглобатные, флегмонозные угри, после которых, как правило, формируются проявления постакне (в виде рубцов, поствоспалительных пигментных пятен). При этом ухудшается как физическое, так и психическое здоровье человека. Отмечена тенденция к увеличению заболеваемости акне. На фоне крайне высокой (90-95%) пора- женности акне у подростков наблюдается повышение частоты заболевания среди лиц старше 25 лет. Вызывает беспокойство увеличение числа тяжелых, длительно рецидивирующих и плохо поддающихся лечению клинических форм акне. Одной из основных причин, объясняющих необходимость поиска новых методов лечения акне, является быстрое развитие антибиотикорезистентности Propionibacterium acnes - наиболее распространенного возбудителя данного заболевания [2]. Повторные длительные курсы антибиотикотерапии при акне, а также частое и не всегда необходимое применение противомикробных препаратов еще больше Рис. 1. Общий вид аппарата ЛАЗУРИТ-АКНЕ. 1 - электронный блок; 2 - манипуляционный держатель головки-облучателя; 3 - головка-облучатель; 4 - мобильный столик. усугубляют проблему резистентности возбудителей и затрудняют лечение данной категории больных. При назначении антибиотиков также необходимо учитывать особенности этиологической природы акне в различных группах больных, регионах и при разных клинических формах. Таким образом, разработка аппаратных физических методов и схем лечения акне является весьма актуальной. При этом наибольшее внимание направлено на разработку и освоение методик, связанных с инактивацией микроорганизмов при помощи света. Ультрафиолетовое излучение (УФ) давно и широко применяется в дерматологии в первую очередь благодаря его воздействию на синтез ДНК в клетках кожи [3]. Взаимодействие видимого излучения с фотосенсибилизирующими молекулами используется для разрушения различных клеток и называется фото- динамической инактивацией [4, 5]. Данная методика разработана для лечения рака и ряда других заболеваний [6]. В условиях in vitro для фотоинактивации бактерий, грибов, дрожжей, вирусов и паразитов с успехом использовались источники света различных длин волн [2, 6]. Более того, недавние исследования показали, что чувствительность к фотосенсибилизатору бактериальных клеток не зависит от их чувствительности к антибиотикам [7]. В настоящем исследовании была предпринята попытка фотоинактивации бактериальных клеток без применения фотосенсибилизатора. Известно. что воздействие видимого излучения, в частности фиолетового с длиной волны 405 нм, вызывает гибель определенных видов бактерий, в том числе P acnes, Helicobacter pylori и других [8, 9]. Этот механизм инактивации является кислородозависимым и, как полагают, возникает в результате фотовозбуждения естественных эндогенных порфиринов, которые действуют как эндогенные фотосенсибилизаторы в бактериальной клетках. Фотовозбуждение порфири- на приводит к передаче энергии и в конечном счете к получению цитотоксического синглетного кислорода [10]. Предыдущие исследования показали, что золотистый стафилококк также погибает при фото- динамическом воздействии с использованием света с длиной волны 400-420 нм [11-15]. Такая инактивация золотистого стафилококка возникает в результате порфиринопосредованного процесса, аналогичного наблюдаемому при P acnes [12, 16]. Целью настоящего исследования явилась оценка бактерицидных свойств низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) при длине волны 405 и 650 нм в условиях in vitro применительно к P acnes, вызывающих угревую болезнь. Материалы и методы В качестве источника лазерного излучения мы использовали аппарат ЛАЗУРИТ-АКНЕ (ООО «ТРИМА», Россия) (рис. 1). Данный аппарат содержит головку-облучатель с 9 лазерными диодами, 5 из которых обеспечивают излучение в фиолетовой области спектра с длиной волны 405 нм, а остальные - в красной (650 нм). Мощность излучения каждого лазера составляет 100 ± 10 мВт. В основе оценки эффективности воздействия лазерного излучения лежала методика флюоресцентной спектроскопии. Диагностический метод реализован в установке Селкол и описан нами ранее [17]. Установка Селкол представляет собой осветитель и регистратор, сопряженный с персональным компьютером. Осветитель выполнен в виде рефлектора, в котором размещено 112 светоизлучающих диодов с пиком излучения на длине волны 405 нм. Плотность мощности возбуждающего излучения составляет 8 мВт/см2. Перед объективом регистрирующего устройства (в нашем случае цифровая камера Nikon- D 90) закрепляется отсекающий светофильтр. Материал для исследования брали у 12 пациентов с акне II степени тяжести (8 женщин и 4 мужчины, средний возраст 19 ± 1,3 года). Группу сравнения составили 9 лиц того же возраста без явлений акне или иной воспалительной патологии кожи. Все пациенты группы с акне не получали за последний год лечения системными антибактериальными препаратами и системными ретиноидами, а также никакого наружного лечения в течение последних 2 нед до начала исследования. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statis- tica v.10.0. Обследование пациентов на микрофлору м * * * * # ж Яг *шЯШ » '* щ> * *.. i • 'V « * • * Ш Щ Jr ' - ф 9 W т Ч Рис. 3. Оранжево-красная флюоресценция колоний P. acnes. * t ё 1-я группа (1 = 405нм) 2-я группа = 405+650 нм 3-я группа = 650 нм) :)(1 )(1 До облучения Рис. 2. Рост культуры P. аcnes. кожи выполняли после клинической диагностики по месту лечения. Материал брали с пораженных участков кожи - участков наибольшей концентрации воспалительных и/или невоспалительных элементов. Для посевов методом отпечатков использовали бакпечатки - стерильные герметичные пластиковые контейнеры. В бакпечатки диаметром 2,4 см и площадью 4,52 см2 (производитель «Ленмедполимер» Санкт-Петербург) заливали 1,5 мл расплавленной агаровой селективной среды. Сразу после заливания среды бакпечатки закрывали и облучали УФ-светом 20-30 мин. После данной процедуры их использовали в течение 2-3 нед. Для посева микрофлоры кожи предпочтительными являются закрытые одеждой поверхности кожи и лицо, особенно хронически незаживающие участки. Лицо принято считать наиболее вероятным местом обитания резидентной (постоянной) микрофлоры кожи человека. Бакпечатки открывали, осторожно прижимали агар к коже и держали в течение 20 с, после чего помещали в термостат. Результат анализа оценивали на основании следующих показателей: наличия данного вида (рода) микроорганизмов в перечне клинически значимых и количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в расчете на 1 дм2 кожи. Расчет проводили по формуле: КОЕ 120 = КОЕ 2, где КОЕ 1 - число колоний, выросших на бакпечатке; КОЕ 2 - количество КОЕ на 1 дм2 кожи [18]. У всех 12 пациентов из группы больных удалось высеять P acnes. Селективной средой для данного вида бактерий является плотная питательная среда Вильсона-Блера (рис. 2). У пациентов без признаков акне обнаружились лишь стафилококк и липофиль- ные дрожжи рода Malassezia. Основным диагностическим критерием являлось наличие оранжево-красного свечения колоний P. acnes в чашках Петри (рис. 3). Данные образцы были разделены на 3 группы. 1-я группа в течение 2 нед находилась под ежедневным 10-минутным воздействием лазерного излучения фиолетовой области спектра (405 нм) аппарата ЛА- ЗУРИТ-АКНЕ, 2-я группа - под воздействием смешанного фиолетово-красного лазерного излучения также в течение 10 мин. В 3-й группе производили облучение только лазерным излучением красного диапазона 650 нм. Плотность потока излучения составляла 90 мВт/см2. Расстояние от головки излучателя до поверхности питательной среды равнялось 5 см. Эффективность лазерного излучения оценивали ежедневно в течение 10 дней на основе метода флюоресцентной спектроскопии. Для этого проводили фотографирование колоний P. acnes с помощью установки Селкол. Получаемые снимки использовали для создания синтезированных изображений путем их совмещения с обработанными участками флюоресценции. Обработку полученных изображений выполняли с помощью алгоритма, описанного нами ранее [17]. Результаты и обсуждение Средний уровень флюоресценции во всех трех группах исследования составил 40 ± 2,2 усл. ед. (см. таблицу). В 1-й группе, в которой использовали только излучение фиолетовой области спектра, мы наблюдали статистически значимое дозозависимое снижение оранжево-красной флюоресценции по всей площади бактериальных колоний (р < 0,001). Максимальное ее уменьшение (92,1%) было достигнуто к 10-му дню исследования. Средний уровень флюоресценции в данной группе исследования после воздействия излучения в диапазоне 405 нм составил 3,9 ± 0,5 усл. ед. Интенсивность аутофлюоресценции колоний P acnes после воздействия НИЛИ с различной длиной волны (I) Через 10 сеансов 3Q ± 0 5* 34 ± 0 3* 38 7 ± 2 2 воздействия НИЛИ 3,9 ± 0,5 3,4 ± 0,3 38,7 ± 2,2 Примечание. * - p < 0,001 по сравнению со значениями до облучения. 39,2 ± 2,1 39,3 ± 1,8 41,1 ± 2,6 Интенсивность флюоресценции, усл. ед. 100 -| 90 - 80 - 70 - 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 - О - 1 2 3 Рис. 4. Снижение уровня аутофлюоресценции после 10 сеансов облучения НИЛИ с различной длиной волны. 1 - X = 405 нм; 2 - X = 405 + 650 нм; 3 - X = 650 нм. Во 2-й группе, в которой прибегали к смешанному излучению (фиолетового и красного диапазона), уменьшение оранжево-красного свечения к 10-му дню исследования оказалось несколько более выраженным, чем в 1-й группе (95,5%). Средний уровень флюоресценции в данной группе после воздействия излучения в диапазоне 405 и 650 нм составил 3,4 ± 0,3 усл. ед. В 3-й группе, в которой использовали излучение красного диапазона 650 нм, значительного уменьшения флюоресцентного сигнала к 10-му дню исследования достигнуто не было (15,5%). Средний уровень флюоресценции в данной группе после воздействия излучения в диапазоне 650 нм составил 38,7 ± 2,2 усл. ед. Таким образом, полученные результаты указывают на наличие бактерицидных свойств у волн обеих длин. Однако спектр излучения 405 нм оказывает более выраженное влияние на жизнеспособность P acnes (рис. 4). Данное исследование убедительно продемонстрировало бактерицидное действие НИЛИ с длиной волны 405 нм на грамотрицательные бактерии P acnes, которые инактивировались благодаря фотостимуляции эндогенных порфиринов, имеющих в своем составе копропорфирин III высокого уровня [16]. Пиковой длиной волны поглощения этих пор- фиринов для оптимальной фотостимуляции является именно фиолетовый спектр видимого излучения. Также мы обнаружили, что при сочетанном воздействии лазерного излучения двух спектров - фиолетового (405 нм) и красного (650 нм) - интенсивность оранжево-красной флюоресценции уменьшается несколько быстрее. Это свидетельствует о более выраженном фотоинактивирующем эффекте, но недостаточном для оправдания присутствия в конструкции аппарата ЛАЗУРИТ-АКНЕ красных лазеров. Однако известные биологические эффекты красного лазерного излучения позволяют рассчитывать на более выраженное клиническое действие при использовании двух видов лазерного излучения в клинических исследованиях in vivo. Можно заключить, что при помощи достаточно низких доз НИЛИ 405 нм обеспечивается альтернатива антибиотикотерапии при лечении акне. Наши результаты показывают, что при этом происходит фотоинактивация более 95% штаммов P acnes менее чем за 10 мин ежедневного воздействия.

About the authors

Ekaterina M. Galkina

State budgetary educational institution of higher professional education “V.I. Razumovsky Saratov State Medical University”, Russian Ministry of Health

Email: kalinina13@mail.ru
Saratov

Yu. M Raigorodsky

“TRIMA” Ltd.

Saratov

References

Supplementary files