The rationale for the application of low-frequency ultrasound in chondroitin sulfate ultraphonophoresis for the treatment of arthritis

Full Text

Важную роль в функционировании организма играет опорно-двигательная система, одной из структурных единиц которой является сустав. Дегенеративные изменения в суставах происходят интенсивно при старении организма, а также при воздействии самых разнообразных повреждающих факторов [1-3]. Основным методом лечения патологических состояний такого рода является применение стероидных и нестероидных противовоспалительных средств, однако их использование может сопровождаться серьезными побочными эффектами [4-6]. Исследования некоторых авторов свидетельствуют о наличии выраженного терапевтического эффекта (купирование воспаления и восстановление структуры хрящевой ткани и функций суставов) такого лечебного физического фактора, как низкочастотный ультразвук (НУЗ), который, как и высокочастотный ультразвук, оказывает противовоспалительное, обезболивающее, противоотечное действие [7-12]. Установлено, что ультразвуковые колебания низкой частоты стимулируют клеточную пролиферацию и продукцию протеогликанов в хондроцитах [7, 11, 13]. Основой реабилитационной терапии патологических состояний суставов является применение хондропротекторов - лекарственных препаратов, улучшающих метаболизм хряща и замедляющих его деструкцию и оказывающих противовоспалительное действие [14-17]. Хондроитина сульфат (ХС) является одним из компонентов экстрацеллюляр- ного матрикса соединительной ткани. У больных с артритами, остеоартрозами метаболизм ХС нарушен [2, 19-21]. Фармакокинетические исследования показали, что при пероральном приеме биодоступность хондропротективных препаратов составляет 13-15% ввиду больших размеров молекулы ХС, тогда как при наружном применении его биодоступность увеличивается до 20-40% [22]. Это делает актуальным наружное применение препаратов ХС в комплексном лечении заболеваний суставов. Целью настоящей работы явилось изучение действия НУЗ разных параметров на структуру и функцию ХС с целью обоснования его использования для уль- трафонофореза при артрите. Материалы и методы Как известно, разработке и внедрению в практику физико-фармакологических методов (электрофорез, ультрафонофорез, магнитофорез и др.) предшествует изучение влияния физического фактора на структуру и фармакологические свойства лекарственного вещества. В свете этих требований и выполнялась настоящая работа. В серии экспериментов, проводимых in vitro, исследовалось влияние НУЗ (частотой 22 кГц) различной интенсивности (0,4, 0,6 и 1 Вт/см2) при непрерывном режиме воздействия и времени экспозиции - 10 мин (с применением аппарата "Тульпан", разработанного в Беларуси) на структуру ХС. Использовалась контактная стабильная методика воздействия: излучатель устанавливался неподвижно в емкость с растворами различной концентрации ХС. Для оценки сохранности структуры препарата регистрировались спектры поглощения и флюоресценции до и сразу после озвучивания НУЗ указанных параметров. Запись спектров проводилась в Институте физиологии и Институте физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси на спектрофлюориметрах SOLAR CM 2203 (Беларусь) и Hitachi (Япония). До и после озвучивания НУЗ также измеряли вязкость растворов ХС (с использованием капиллярного вискозиметра ВПЖ-3). На животных (крысах) исследовалось влияние НУЗ на течение воспалительного процесса в голенопредплюсневом суставе. Модель экспериментального артрита создавали введением в полость сустава 1,5% раствора зимозана в объеме 0,2 мл. У всех сформированных 3 групп животных (контрольная и 2 опытные) вызывали артрит. В течение 4 сут оценивалась степень формирования воспалительного процесса: величина отека, визуальная оценка сустава, поведенческие особенности животных. Оценку внешних проявлений артрита проводили в баллах: 0 баллов - артрит отсутствует, 1 балл - слабый артрит, 2 балла - умеренный артрит, 3 балла - выраженный артрит [23]. Рис. 1. Спектры поглощения ХС. 1 - 0,3% нативного раствора; 2 - после озвучивания НУЗ частотой 22 кГц, с интенсивностью 0,4 Вт/см2, 3 - с интенсивностью 0,6 Вт/см2; 4 - с интенсивностью 1 Вт/см2. Животным опытной группы № 1 проводили озвучивание НУЗ зоны патологии (голеностопного сустава), а животным опытной группы № 2 - ультрафо- нофорез хондропротектора (НУЗ частотой 22 кГц, интенсивностью 0,2 Вт/см2 в течение 5 мин с нанесением мази "Хондроксид" объемом 1 см2) в течение 7 дней. По окончании курса процедур животных выводили из эксперимента путем декапитации после наркотизирования и осуществляли забор материала для морфологического исследования. Для этого отбирали образцы всех компонентов тканей сустава в виде суставного блока и приготавливали криостатные срезы толщиной 8-10 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином и нитросиним тетразолием и анализировали с использованием светового микроскопа. Для документации данных производился перенос изображения с гистологических препаратов на электронные носители при помощи установки, состоящей из цифровой фотокамеры и персонального компьютера. Активность ферментов, характеризующих метаболическую активность клеток, сукцинат- и лак- татдегидрогеназу (СДГ и ЛДГ), определяли тетра- золиевым методом по методике Лойда. Активность ферментов оценивали на основании определения оптической плотности продукта реакции в цитоплазме клеток с помощью компьютерной программы обработки данных Image J, выражая результаты в условных единицах (у.е.) оптической плотности, учитывая по 100 клеток в каждом из 5 срезов. Изучение микропрепаратов, морфометрию и изготовление микрофотографий проводили с помощью светового микроскопа MPV-2 с программным обеспечением и компьютером (производитель "Leitz", Германия). Статистическая обработка проводилась методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М) и ее ошибки (m), коэффициента достоверности Стьюдента (t), вероятности достоверности сравниваемых величин (р). Различия рассматривались как достоверные при р < 0,05. Расчеты и графическое оформление проводили с использованием программы Microsoft Excel [24]. Результаты и обсуждение На первом этапе исследования с целью оценки структурной устойчивости препарата к ультразвуку изучены оптические свойства ХС, для чего проводилась запись его спектров поглощения и флюоресценции. Электронные спектры поглощения исследуемого ХС до и после воздействия НУЗ представлены на рис. 1. После озвучивания раствора ХС (0,3% раствор) НУЗ частотой 22 кГц и интенсивностью 0,4 и 0,6 Вт/см2 не выявлено существенных различий в характере спектра и максимумов поглощения, что свиде- 0 1-1------------------------------- 1- 1- 200 250 300 нм тельствует об отсутствии изменений структуры ХС под действием УЗ малой и средней интенсивности. Спектры поглощения ХС имеют два максимума поглощения в коротковолновой УФ-области, сохраняющиеся и при воздействии УЗ интенсивностью 0,4 и 0,6 Вт/см2. При увеличении интенсивности озвучивания до 1 Вт/см2 наблюдается изменение характера спектра поглощения в виде небольшого повышения оптической плотности раствора при сохранении структуры спектра поглощения. Наряду со спектрами поглощения нами регистрировался и спектр флуоресценции ХС до и после озвучивания. Как известно, спектр флюоресценции сдвинут относительно спектра поглощения в сторону длинных волн. Длина волны возбуждающего света обычно выбирается равной длине волны максимума спектра поглощения. В конкретном случае (см. рис. 1) она равнялась 265 нм. Спектры флуоресценции раствора ХС нативного и обработанного УЗ терапевтических параметров были идентичны. Это подтверждает сохранение структуры хондропротекторного препарата при воздействии на него УЗ изученных терапевтических интенсивностей и указывает на возможность его использования для ультрафонофореза. С целью выяснения сохраняются ли нативные свойства хондропротектора ХС после действия НУЗ дополнительно проведена оценка изменения вязкости растворов ХС различных концентраций до и после озвучивания. Учитывая тот факт, что в клинической практике используются препараты, содержащие в своем составе от 1 до 10% ХС, проведено исследование растворов ХС с концентрациями 1, 5 и 10%. С помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-3 измерялась вязкость данных растворов ХС до и после озвучивания. Каждое исследование повторялось 3 раза. Всего сделано 60 измерений. Плотность растворов ХС измеряли ареометрами, и она составила для 1, 5 и 10% растворов соответственно 1,001, 0,995 и 0,994 кг/м3. Расчет вязкости проводили по формуле: п = к • t • d, где к - коэф- фициент вискозиметра (равен 1,666); t - время течения жидкости; d - удельная плотность раствора в г/см2. Усредненные данные соответствующих измерений приведены в табл. 1. Т аблица 1 Влияние озвучивания НУЗ (частота 22 кГц, интенсивность 0,4 и 1 Вт/см2) растворов ХС на их вязкость Концентрация раствора ХС, % Время протекания раствора до озвучивания НУЗ, с Время протекания раствора после озвучивания (0,4/1 Вт/см2), с Вязкость растворов ХС до озвучивания, мПа/с Вязкость растворов ХС после озвучивания НУЗ (0,4/1 Вт/см2), мПа/с 1 1,40 ± 0,03 1,29 ± 0,03/1,34 ± 0,04 2,41 2,15/2,24 5 2,99 ± 0,02 2,78 ± 0,05/2,81 ± 0,05 5,05 4,71/4,75 10 6,59 ± 0,07 6,43 ± 0,04/6,58 ± 0,06 11,3 11,10/11,34 Вязкость 1% раствора ХС после воздействия НУЗ (0,4 Вт/см2) снижалась на 10,8% относительно исходных данных, 5% раствора - на 6,7% и 10% раствора - на 1,8% соответственно, а при увеличении интенсивности НУЗ до 1 Вт/см2 изменения составили для 1% раствора - 7,1%, для 5% раствора- 5,95% и 10% раствора- 0,65%. В приведенных данных обращают на себя внимание следующие моменты. Во-первых, во всех опытах озвучивание растворов ХС различных концентраций сопровождалось тенденцией (p > 0,05) к уменьшению их вязкости. Во-вторых, уменьшение вязкости растворов ХС весьма своеобразно зависело от интенсивности ультразвука: оно было несколько большим при использовании более низкой (0,4 Вт/см2) дозировки физического фактора. Это указывает на неодинаковый характер происходящих сдвигов в растворе ХС под влиянием УЗ различных терапевтических интенсивностей. Возможно, незначительные изменения вязкости в сторону ее увеличения либо снижения под влиянием НУЗ можно объяснить изменением подвижности связей макромолекул ХС, изменением их гидратации, распадом ассоциатов или образованием комплексов с различным числом молекул. В-третьих, данные спектрофотометрии озвученных растворов незначительно различаются с результатами виско- зиметрических исследований: спектры поглощения препарата изменились только после озвучивания при интенсивности 1 Вт/см2, в то время как вязкость его растворов больше уменьшалась при использовании ультразвука интенсивностью 0,4 Вт/см2. Наблюдаемое некоторое расхождение спектрофотометрических и вискозиметрических данных, по-видимому, отражает различный характер выявляемых этими методами изменений в растворах ХС, подвергнутых воздействию НУЗ, и подчеркивает необходимость комплексного подхода (с использованием различных методов) к разработке условий фонофореза лекарственных веществ. Сохранение оптических и гидродинамических свойств растворов ХС после действия ультразвуковых волн, свидетельствующее об отсутствии разрушения хондропротектора данным физическим фактором, указывает на пригодность данного препарата для лекарственного ультрафонофореза, т.е. для введения его в организм НУЗ терапевтических дозировок. У животных с экспериментальным зимозановым артритом контрольной и опытных групп на 7-е сутки после введения зимозана в голенопредплюсневый сустав правой задней лапы отмечалась его выраженная отечность, развивался синовит, определялась деформация сустава, кожа над суставом имела красновато-синюшный цвет (табл. 2). На 14-й день развития воспаления у животных контрольной группы отек в области правого голенопредплюсневого сустава увеличился, по-прежнему наблюдалась деформация сустава, у 30% животных сохранялись признаки гиперемии кожной поверхности вокруг больного сустава. Таблица 2 Характеристика артрита до и после применения НУЗ и фонофореза хондроитина сульфата Воздействие НУЗ (22 кГц; 0,2 Вт/см2) Фонофорез ХС (22 кГц; 0,2 Вт/см2) Показатель контрольная группа опытная группа № 1 контрольная группа опытная группа № 2 Оценка артрита на 7-е сутки, балл 1,5 ± 0,17 1,8 ± 0,20 1,6 ± 0,16 1,6 ± 0,2 Оценка артрита на 14-е сутки, балл 2,38 ± 0,18* 1,6 ± 0,24 2,04 ± 0,17* 1,3 ± 0,23* Окружность сустава на 7-е сутки, см 3,22 ± 0,08 3,44 ± 0,09 3,28 ± 0,12 3,29 ± 0,08 Окружность сустава на 14-е сутки, см 3,78 ± 0,11* 3,24 ± 0,19 3,60 ± 0,08 3,07 ± 0,12 Примечание. * - p < 0,05 в сравнении с 7-ми сутками. У крыс опытной группы N° 1, подвергшихся действию НУЗ, также сохранялись признаки воспалительной реакции, однако их выраженность была менее значительной - признаки гиперемии кожи у всех животных отсутствовали, отек сустава значительно уменьшился. Следует отметить, что у здоровых ин- тактных крыс окружность как правого, так и левого суставов была одинакова и составляла 2,29 ± 0,03 см и к 14-му дню эксперимента равнялась 2,31 ± 0,04 см. В контрольной группе воспалительный процесс в течение периода наблюдений продолжал нарастать, о чем свидетельствовало дальнейшее увеличение окружности сустава (на 14-е сутки развития артрита прирост составил 17,4%). В результате воздействия НУЗ окружность воспаленного сустава у животных опытной группы уменьшилась на 5,8% (p > 0,05) после 7 процедур. У крыс опытной группы № 2, подвергшихся фо- нофорезу ХС, также сохранялись признаки воспалительной реакции, но их выраженность различалась: к 14-м суткам в контрольной группе показатели артрита по балльной системе увеличились на 27,5%, а в этой опытной - снизились на 18,75%. Окружность воспаленной конечности у первых возросла на 9,7%, тогда как у вторых снизилась на 6,7%. На 14-й день развития воспаления в контрольной группе животных (сформирован артрит) регистрировались выраженные дегенеративно-дистрофические изменения во всех составных компонентах "синовиальной среды сустава": в суставной сумке, синовиальной оболочке, полости сустава и в суставном хряще. Синовиальная оболочка сустава была отечна, гиперемирована, гипертрофирована. В ней наблюдались пролиферация синовиоцитов, возрастание пространств между волокнами (рис. 2, а на 3-й стр. обложки). Воспалительный лейкоцитарный инфильтрат был виден во всех слоях и элементах "синовиальной среды сустава" (рис. 2, б на 3-й стр. обложки). Деструктивные изменения хряща обнаруживались во всех слоях, имеющих нечеткие очертания и границы. В поверхностном слое, который был истончен и разволокнен, выявлялись уплощенные и одиночные хондроциты. В промежуточном слое встречались пустые лакуны, много клеток с пикнотизиро- ванными ядрами. В суставном хряще, кроме хондроцитов с четкой структурой ядра и цитоплазмы, встречалось большое количество измененных хрящевых клеток (рис. 3, а на 3-й стр. обложки). Нередко эти изменения сводились к цитолизу с явлениями лизиса как цитоплазмы, так и ядра хондроцита. При окраске по методу Лойда в цитоплазме клеток регистрировалась высокая активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (рис. 3, б на 3-й стр. обложки). Результатом действия НУЗ с частотой 22 кГц и интенсивностью 0,2 Вт/см2 на воспаленный сустав явилось значимое визуальное уменьшение признаков воспаления (см. табл. 2). В синовиальной оболочке сустава отмечалось снижение объема лейкоцитарного инфильтрата. На гистологических препаратах в суставном хряще отмечена структурная гетерогенность хондроцитов, находящихся на разной стадии функциональной активности. Указанное выше ультразвуковое воздействие благотворно сказывалось на обменных процессах в клетках синовиальной среды сустава, что подтверждалось гистохимическими исследованиями активности окислительно-восстановительных ферментов. Так, после курсового воздействия НУЗ повышалась активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в синови- оцитах и хондроцитах соответственно на 11 и 28% по сравнению с животными контрольной группы. Таким образом, можно утверждать, что НУЗ данных параметров оказывает выраженное противовоспалительное и трофико-стимулирующее действие на процессы в тканях сустава. В результате проведения 6-8 процедур ультра- фонофореза с хондропротектором на область голенопредплюсневого сустава крысам с экспериментальным артритом в суставных тканях регистрировались признаки остаточного воспалительного процесса, что выражалось в небольшом отеке суставной сумки и распространенной смешанно-клеточной инфильтрации. Воспалительный лейкоцитарный инфильтрат наблюдался во всех слоях синовии, однако, визуально численность и площадь воспалительных клеточных инфильтратов были намного меньше по сравнению с таковыми суставами не только нелеченых контрольных крыс с экспериментальным артритом, но и получавших ультразвуковую терапию. Синовиальная оболочка была гипертрофирована. Синовиоциты местами пролиферировали, формируя несколько рядов продолговатых клеток фибробластического ряда (рис. 4 на 3-й стр. обложки). Соединительнотканные волокна переходной зоны (области перехода между синовиальными клетками и хондроцитами) частично были разволокнены с оптическими пустотами между ними. Рис. 5. Участок суставного хряща крыс с экспериментальным артритом после ультрафонофореза хондропротектора. Микрофото. Метод ЛДГ. Ув. 25. Черными стрелками обозначены хрящевые клетки (хондроциты), белыми - монетные столбики. 1 -межклеточное вещество. У животных этой группы после применения лекарственного ультрафонофореза в синовиоцитах выявлена активизация аэробного окисления глюкозы (фермента СДГ) по сравнению с животными с экспериментальным артритом. Значение этого фермента в синовиоцитах составляло при экспериментальном артрите - 63,64 ± 7,2 у.е., а при сочетанном воздействии - 75,16 ± 7,9 у.е. (увеличение на 18,1%). При этом активность анаэробных процессов снизилась на 18,7% по сравнению с артритом и составляла 112,2 ± 10,8 у.е. (в контроле 137,8 ± 9,9 у.е.). Исследование суставного хряща в опытных группах показало, что его строение было близким к таковому при воздействии одним УЗ. При ультрафонофо- резе хрящевой матрикс практически не разрушался, округлой и овальной формы хондроциты располагались группами по 2-3 клетки в одной лакуне и были разобщены межклеточным веществом (рис. 5, а), что характерно для физиологической нормы. Здесь значительно чаще встречались делящиеся клетки, которые образовывали так называемые "монетные столбики" (рис. 5, б). В результате проведения гистохимического исследования после сочетанного воздействия в хон- дроцитах выявлены незначительные метаболические изменения. Так, на 14-е сутки в хрящевых клетках выявлялось увеличение активности СДГ до 55,02 ± 7,3 у. е. (в группе с артритом до 50,21 ± 6,9 у. е.) и снижение активности ЛДГ до 135,19 ± 10,7 у. е. (в группе с артритом - 140,61 ± 11,1 у. е.). Следует отметить, что в результате проведенного микроскопического исследования выявлены стереотипные структурные изменения в суставных тканях животных, подвергшихся раздельному и сочетанному воздействию низкочастотного УЗ и ультрафонофореза хон- дропротектора: незначительная воспалительная инфильтрация клетками лейкоцитарного ряда, пролиферация синовиоцитов, гетерогенность хондроцитов. Важно подчеркнуть, что при ультрафонофорезе хондрои- тина сульфата положительные морфологические изменения были выражены сильнее и отмечались у большего количества животных. При гистохимическом исследовании установлена разнонаправленная реакция со стороны клеток синовиальной оболочки и суставного хряща крыс с экспериментальным артритом на ультрафонофорез хондропротектора. Так, после сочетанного воздействия активизация окислительно-восстановительных процессов в цикле Кребса, свидетельствующая о повышении функциональной активности клеток, регистрировалась только в сино- виоцитах, о чем свидетельствовало значимое повышение активности его ключевого фермента - СДГ и в то же время выражено снижение активности анаэробных процессов (ЛДГ). В хондроцитах значимое увеличение показателей фермента СДГ отмечалось при раздельном воздействии только УЗ. Следовательно, по результатам гистохимического исследования наиболее выраженный противовоспалительный и трофикостимулирующий эффект наблюдался после ультрафонофореза хондропротекторного препарата в клетках синовиальной оболочки. В хрящевых клетках эти процессы выражены слабее. Таким образом, выполненные in vitro эксперименты свидетельствуют об отсутствии структурных изменений ХС при воздействии низкочастотным ультразвуком терапевтических интенсивностей, а исследования на модели экспериментального артрита подтвердили сохранение и потенцирование фарма- котерапевтических свойств хондропротектора при его низкочастотном ультрафонофорезе. Полученные данные указывают на пригодность ХС для сочетанного использования с низкочастотным (22 кГц) ультразвуком и обосновывают целесообразность применения ультрафонофореза этого препарата при воспалительно-дегенеративных заболеваниях суставов. Настоящее заключение подтверждают и хорошие результаты применения фонофореза ХС при травмах и заболеваниях опорно-двигательного аппарата у спортивных лошадей [25].

About the authors

I. L Morozova

Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus

220072, Minsk, Republic of Belarus

N. V Voichenko

Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus

220072, Minsk, Republic of Belarus

E. L Ryzhkovskaya

Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus

220072, Minsk, Republic of Belarus

T. E Kuznetsova

Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus

220072, Minsk, Republic of Belarus

Vladimir S. Ulashchik

Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus

Email: biblio@fizio.bas-net.by
220072, Minsk, Republic of Belarus

References

Supplementary files