Противосудорожное действие импульсных магнитных полей в электрошоковой модели (экспериментальное исследование)

Полный текст

Для оценки и определения противоэпилептиче-ских свойств различных лекарственных препаратов либо немедикаментозных средств (физических факторов) исследователи используют программу ADDP (Antiepileptic Drug Development Program). Первый этап выявления потенциальных противоэпилеп-тических свойств проводят на моделях первично-генерализованных судорог, вызванных электрическим (тест максимального электрошока — МЭШ) и химическим (тест антагонизма с коразолом) воздействием [6]. Тест МЭШ считается одним из золотых стандартов для скрининга антиконвульсантов, который был предложен в 40-е годы прошлого столетия и в настоящее время является наиболее используемым для оценки противосудорожного действия [9, 12, 16]. Во время проведения теста МЭШ лабораторные животные подвергаются воздействию электрическим стимулом, вызывающим у них максимальную тоническую экстензию задних конечностей (МТЭЗК), что является критерием противосудорожного действия оцениваемого препарата, тормозящего развитие припадка у 50% животных (ЭД50 - эффективная доза) [6, 13]. Высокая корреляция между возможностью препарата тормозить возникновение судорог при МЭШ и его эффективностью купировать тонико-клонические припадки у человека делает данный тест востребованным [14, 15]. При выполнении традиционного теста МЭШ на крысах используется электрический импульс, интенсивность которого достаточна, чтобы вызвать у 100% контрольных животных максимальные тонические судороги задних конечностей, тоническое напряжение мышц туловища длительностью 10-15 с, последующее развитие стадии клонических подергиваний в мышцах задних конечностей и туловища, после которой животное может самостоятельно принять положение сидя и начать двигаться [6, 10, 11]. Порог судорожной готовности обычно определяется методом вверх и вниз, принцип которого заключается в увеличении или уменьшении величины силы тока или напряжения стимула на 0,06 интервала при исследовании у мышей и на 0,6 интервала у крыс до появления МТЭЗК. Данные порога МЭШ, полученные в группе из 15-20 животных, используют для вычисления значений тока, вызывающего МТЭЗК у 50% особей, конвульсивный ток (КТ) или конвульсивный вольтаж (КВ50). Для оценки эффективности действия препарата вычисляют его дозу, увеличивающую судорожный порог на 20%, применяя полулогарифмическую шкалу [17]. Таким образом, тест МЭШ является наиболее широко используемой моделью судорог, поскольку позволяет легко воспроизвести первично-генерализованный эпилептический припадок. Препараты, блокирующие судороги в электрошоковой модели, показали высокую клиническую эффективность в лечении генерализованных тонико-кло-нических судорог и парциальных припадков. Цель настоящей работы - изучить закономерности противосудорожного действия импульсных магнитных полей (ИМП) с различными параметрами в электрошоковой модели судорог. Одной из задач исследования явилась сравнительная оценка противосудорожного действия ИМП в зависимости от его модуляционных биофизических параметров на экспериментальной модели первично-генерализованных судорог, какой является электро-шоковая модель. Материалы и методы Исследование выполнено рандомизированно на беспородных половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar массой тела 200—300 г. Соблюдались правила проведения работ с использованием экспериментальных животных. Проведение эксперимента одобрено Комитетом по этике Белорусской медицин и 4/2012 ФИЗИОТЕРАПИЯ, БАЛЬНЕОЛОГИЯ и РЕАБИЛИТАЦИЯ ской академии последипломного образования. Опытная группа (n = 450) была разделена на 45 подгрупп в зависимости от частоты (0,1; 0,3; 0,5; 1,0 и 10,0 Гц) и интенсивности (10, 20 и 40% от максимальной магнитной индукции (ММИ) кольцевого коила) импульсного магнитного поля, а также количества процедур ритмической транскраниальной магнитной стимуляции (рТМС) (1, 3 или 10). Транскраниальное воздействие импульсным магнитным полем проводилось после помещения меченных пикриновой кислотой крыс в специальные прозрачные контейнеры. Индуктор располагали непосредственно над головами животных. Транскраниальную магнитную стимуляцию (ТМС) выполняли в течение 5 мин импульсным магнитным полем бифазными импульсами (длительность импульса 250 мкс) с интервалом между пачками импульсов 1 с и длительностью пачки 10 с. Для рТМС использовался аппарат Нейро-МС (Россия). В целях оптимизации выполнения процедур использовалась разработанная нами установка, позволяющая фиксировать крыс и расположить индуктор таким образом, чтобы воздействие ИМП было одинаковым для каждого животного. Более того, данное устройство позволяло выполнять многократное воздействие, которое проводилось ежедневно в одно и то же время суток. Контрольная группа состояла из 42 животных. Для выполнения электрошоковой модели предварительно было определено значение судорожного порога МЭШ, согласно стандартному дизайну исследования [12]. Значение электрического тока, после воздействия которым у всех контрольных животных развился припадок с максимальной тонической экстензией, использовалось нами как стандартное во всех группах [1-4]. Крыса фиксировалась кистью руки исследователя, электрический стимул подавался в области кпереди от ушных раковин после предварительной обработки места стимуляции физиологическим раствором. После нанесения стимула осуществлялось наблюдение за течением припадка с регистрацией длительности и структуры его стадий и фиксацией возникновения определенных феноменов («педалирование» конечностями, «бег на месте», задержка развития максимальной тонической экстензии задних конечностей). Для статистической обработки использовали алгоритмы программы Statistica 6.0 и Biostat. Результаты представлены при уровне достоверной значимо-стир < 0,05. Результаты и обсуждение Изменение структуры припадков в тесте МЭШ. Учитывая, что основным компонентом для оценки противосудорожной эффективности в МЭШ является отсутствие максимальной тонической экстензии задних конечностей у 50% животных в первую очередь анализу подвергался данный показатель (см. таблицу). Отсутствие статистически значимой максимальной тонической экстенции задних конечностей при увеличении числа процедур в различных частотных диапазонах по сравнению с контрольной группой имеет специфические паттерны. Нами было определено наличие несколько их типов. Для частот 10 и 1 Гц - это «ступенеобразный», характеризующийся тем, что с увеличением числа процедур достоверные изменения возникают при увеличении интенсивности ИМП. При стимуляции частотой 0,5 Гц - «зеркальный» асимметричный, когда достоверные изменения после 1-й процедуры возникают при интенсивности 40 и 20% от ММИ, после трех — отсутствуют, а после десяти сессий - при 20 и 10% от ММИ. После рТМС частотой 0,1 Гц обнаружен Х-образный паттерн достоверных изменений, которые возникают после одной и десяти процедур при интенсивности 40 и 10% от ММИ, после трех сессий МТЭЗК достоверно отличается от контроля при всех значениях интенсивности. При рТМС частотой 0,3 Гц отсутствие феномена МТЭЗК достоверно только после трех процедур при интенсивности 20% и после 10 сессий при интенсивности 40% от ММИ. У части животных основной группы наблюдался своеобразный феномен задержки развития МТЭЗК, в то время как в контрольной группе МТЭЗК развивалась сразу после нанесения электрического стимула. После одной процедуры рТМС частотой 10 Гц интенсивностью 20% от ММИ и 0,1 Гц (10 и 20% от ММИ), после трех сессий частотой 10 Гц (10, 20 и 40% от ММИ), частотой 0,1 и 0,3 Гц при интенсивности 40% от ММИ отмечалась значимая задержка МТЭЗК (р < 0,05). После 10 процедур магнитной стимуляции данный феномен возникал во всех используемых частотных диапазонах: 10 и 1 Гц (10% от ММИ), 0,5 Гц (40% от ММИ), 0,3 Гц (10 и 20% от ММИ), 0,1 Гц (20% от ММИ) (р < 0,05). Отсутствие фазы тонических судорог зависело не только от частоты и интенсивности ИМП, но и от количества процедур. Наибольшее число эффективных режимов в отношении данного показателя получено после одной процедуры рТМС - 10 Гц (10% от ММИ), 1 Гц (20 и 10% от ММИ), 0,5 Гц (40 и 20% от ММИ) и 0,1 Гц (10% от ММИ). После трех сессий магнитной стимуляции отсутствие фазы тонических судорог было достоверным только при воздействии ИМП частотой 0,1 Гц при всех значениях интенсивности ММИ. Проведение десяти процедур оказалось эффективным в отношении редукции данной фазы судорог при стимуляции 1 Гц (20% от ММИ) и 0,1 Гц (10% от ММИ) (р < 0,05). Определенное количество режимов, которые приводили к достоверной редукции тонической фазы судорог после однократного воздействия по сравнению с десятикратным, свидетельствует об активации ранних механизмов нейропластичности и возможном избирательном накопительном эффекте после десяти процедур. Достоверное отсутствие фазы генерализованных клонических судорог с потерей рефлекса переворачивания имело место при троекратной стимуляции 0,1 Гц 10% от ММИ и после десятикратной рТМС 1 Гц 20% от ММИ (р < 0,05). ФИЗИОТЕРАПИЯ, БАЛЬНЕОЛОГИЯ и РЕАБИЛИТАЦИЯ 4/2012 Структура припадков в тесте МЭШ в зависимости от количества процедур ТМС Характеристики ИМП % от ММИ Отсутствие максимальной тонической экстензии задних конечностей Отсутствие фазы тонических судорог Отсутствие фазы клонических | судорог количество процедур ТМС | 1 3 10 1 3 10 1 3 10 1 10,0 Гц (п = 30) 40 1 (10) 2 (2) 6 (60)** 0 (0) 1 (10) 3 (30) 0 (0) 0 (0) 3 (30) J 20 4 (40)* 4 (40)* 5 (50)** 2 (20) 2 (20) 1 (10) 0 (0) 1 (10) 1 (10) 10 6 (60)* 5 (50)** 2 (20) 4 (40)* 1 (10) 1 (10) 1 (10) 0 (0) 1 (10) 1,0 Гц (п = 30) 40 1 (10) 3 (30) 4 (40)* 1 (10) 1 (10) 0 (0) 1 (10) 1 (10) 0 (0) 20 5 (50)** 4 (40)* 5 (50)** 4 (40)* 2 (20) 5 (50)** 2 (20) 1 (10) 4 (40)* 1 10 6 (60)** 4 (40)* 2 (20) 5 (50)** 1 (10) 0 (0) 3 (30) 1 (10) 0 (0) 0,5 Гц (п = 30) 40 5 (50)** 3 (30) 1 (10) 5 (50)** 1 (10) 1 (10) 2 (20) 1 (10) 1 (10) 20 4 (40)* 3 (30) 4 (40)* 4 (40)* 3 (30) 2 (20) 1 (10) 2 (20) 2 (20) 1 10 2 (20) 3 (30) 5 (50)** 1 (10) 1 (10) 3 (30) 0 (0) 1 (10) 0 (0) 0,3 Гц (п = 30) 40 1 (10) 1 (10) 4 (40)* 1 (10) 0 (0) 2 (20) 1 (10) 0 (0) 0 (0) 20 3 (30) 7 (70)** 2 (20) 2 (20) 0 (0) 2 (20) 2 (20) 0 (0) 1 (10) 10 3 (30) 3 (30) 3 (30) 2 (20) 1 (10) 1 (10) 2 (20) 0 (0) 0 (0) 0,1 Гц (п = 30) 40 7(70)** 5 (50)* 6 (60)** 0 (0) 4 (40)* 2 (20) 1 (10) 1 (10) 0 (0) 20 1 (10) 4 (40)* 2 (20) 0 (0) 4 (40)* 0 (0) 0 (0) 1 (10) 0 (0) 10 4 (40)* 4 (40)* 6 (60)** 4 (40)* 4 (40)* 4 (40)* 3 (30) 4 (40)* 1(10) 1 Контрольная группа 0 (0) (п = 42) Примечание. Различия значимы в сравнению с контрольной группой ( 0 (0) * - р < 0,05 0 (0) ** - р < 0,01); в скобках - проценты При анализе длительности фазы клонических судорог определялась продолжительность клонусов конечностей, представленных феноменом «педалирования». Статистическая обработка показала, что однократное воздействие всеми используемыми значениями ИМП достоверно редуцирует представленность данного феномена в основной группе по сравнению с контрольной (р < 0,05). Троекратная рТМС приводила к подобному эффекту во всех группах за исключением группы, в которой стимуляция проводилась частотой 10 Гц интенсивностью 10% от ММИ и 0,3 Гц интенсивностью 20 и 10% от ММИ. Аналогичный эффект зарегистрирован также в других подгруппах, где было проведено 10 процедур магнитной стимуляции, кроме режимов 10 Гц (10% от ММИ) и 0,1 Гц (20% от ММИ). Феномен «педалирования» в контрольной группе длился 16 (15-18) с. Длительность данного феномена после однократной, троекратной и десятикратной процедуры рТМС достоверно отличалась от контроля (соответственно р < 0,00001,р < 0,00005,р < 0,02). В структуре припадков в тесте МЭШ в основной группе по сравнению с контрольной наблюдался также феномен, названный нами «бег на месте», который представляет собой клонические судороги без потери рефлекса переворачивания. Наличие его отмечалось только в одной группе после однократной рТМС частотой 10 Гц интенсивностью 10% от ММИ (р = 0,04). На изменение структуры первично-генерализованных судорог в тесте МЭШ наиболее эффективное влияние оказывал режим магнитной стимуляции частотой 1 Гц интенсивностью 20% от ММИ. Полученные данные позволили утверждать об избирательном накопительном эффекте редукции МТЭЗК, а также тонических и клонических судорог. Длительность фазы тонических судорог (ДФТС) в контрольной группе составляла 14,19 (13,4-15,17) с. Значение этого показателя достоверно уменьшалось после одной, трех и десяти процедур только в двух режимах рТМС — 1 Гц 20% от ММИ (р < 0,02) и 0,1 Гц 10% от ММИ (р < 0,019). ИМТ способно избирательно редуцировать длительность тонических судорог в тесте МЭШ, причем линейный характер данного явления (укорочение ДФТС вне зависимости от числа процедур) наблюдается в двух режимах: 1 Гц 20% от ММИ и 0,1 Гц 10% от ММИ (рис. 1). Длительность фазы клонических судорог с утратой рефлекса переворачивания (ДФКС1) в контрольной группе составляла 101,2 (86,7-106,4) с. Данный показатель достоверно уменьшался после одной, трех и десяти процедур во всех режимах рТМС (р < 0,003) без межгрупповых различий. Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности механизмов генерации клонических судорог с утратой рефлекса переворачивания ко всем параметрам ИМП и об универсальном действии рТМС на данную фазу припадка в тесте МЭШ. Длительность фазы клонических судорог после восстановления рефлекса переворачивания (ДФкС2) в контрольной группе составляла 30,6 (18,6-60) с. Изменения данного показателя были детермини- И 4/2012 ФИЗИОТЕРАПИЯ, БАЛЬНЕОЛОГИЯ и РЕАБИЛИТАЦИЯ 20 18 16 14 12 и О ю 18 6 4 2 0 -2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -р< 0,05 KW-H(15,180)=59,0150162; 20 18 16 14 12 о О Ю р=0,0000004 б И I I I I I г~ 1 2 3 4 5 6 *-р<0,05 KW-H(15,180)=57,9174149; р= 20 Ί 18 16 14о 12- £ 100 4 864 -2-о--2- П I I I г~ 7 8 9 10 11 0,0000006 В ~1 I I I I г 12 13 14 15 16 1-1-1-1-1-1-г 1 2 3 4 5 6 *-р<0,05 KW-H( 15,180)=30,7239597; р- I-1-1-1-г~ 7 8 9 10 11 Группы =0,0096 12 13 14 15 16 • Median □ 25-75% ш Min-Max Рис. 1. ДФТС. а - однократная рТМС; б - троекратная рТМС; в - десятикратная рТМС. Группы: 1 - контрольная; 2 - 10 Гц 40% от ММИ; 3 - 10 Гц 20% от ММИ; 4 - 10 Гц 10% от ММИ; 5 - 1 Гц 40% от ММИ; 6 - 1 Гц 20% от ММИ; 7 - 1 Гц 10% от ММИ; 8 - 0,5 Гц 40% от ММИ; 9 - 0,5 Гц 20% от ММИ; 10 - 0,5 Гц 10% от ММИ; 11 - 0,3 Гц 40% от ММИ; 12 - 0,3 Гц 20% от ММИ; 13 - 0,3 Гц 10% от ММИ; 14 - 0,1 Гц 40% от ММИ; 15 - 0,1 Гц 20% от ММИ; 16 - 0,1 Гц 10% от ММИ. 100-1 80- 60- “ 40 Θ с[ 20- 0- -20 -“П-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 *-p<0,05 KW-H( 15,191 )“57,3617084; p=0,0000007 О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 *-p< 0,05 KW-H(15,181)=63,8562959; p=0,00000005 100-, 80- 60- 20- 0- -20-"“i—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—i—i—i—i—I—r 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Группы *-p<0,05 KW-H(15,181 )-46,2417548; p=0,00005 ■ Median □ 25-75% in Min-Max Рис. 2. ДФКС2 (после восстановления рефлекса переворачивания). а - однократная рТМС; б - троекратная рТМС; в - десятикратная рТМС. Группы: 1 - контрольная; 2 - 10 Гц 40% от ММИ; 3 - 10 Гц 20% от ММИ; 4 - 10 Гц 10% от ММИ; 5 - 1 Гц 40% от ММИ; 6 - 1 Гц 20% от ММИ; 7 - 1 Гц 10% от ММИ; 8 - 0,5 Гц 40% от ММИ; 9 - 0,5 Гц 20% от ММИ; 10 - 0,5 Гц 10% от ММИ; 11 - 0,3 Гц 40% от ММИ; 12 - 0,3 Гц 20% от ММИ; 13 - 0,3 Гц 10% от ММИ; 14 - 0,1 Гц 40% от ММИ; 15 - 0,1 Гц 20% от ММИ; 16 - 0,1 Гц 10% от ММИ. [ÜJ ФИЗИОТЕРАПИЯ, БАЛЬНЕОЛОГИЯ и РЕАБИЛИТАЦИЯ 4/2012 рованы режимами рТМС. В случае рТМС частотой 1 Гц достоверное уменьшение ДФКС2 по сравнению с контрольной группой происходило после одной и трех процедур при всех значениях интенсивности (10, 20 и 40% от ММИ) (р < 0,015), а после десяти процедур — только при интенсивности 20% от ММИ (р = 0,016). При воздействии ИМП частотой 0,3 Гц достоверное уменьшение ДФКС2 происходило после одной сессии при любой интенсивности ИМП (р < 0,04), а после трех - только при 20% от ММИ (р = 0,04). ДФкС2 достоверно уменьшалась также после однократной стимуляции частотой 0,5 Гц интенсивностью 20 и 40% от ММИ (р < 0,02) (рис. 2). Общая длительность припадка (ОДП) в контрольной группе составляла 142,1 (128-162,7) с. ТМС во всех подгруппах основной группы достоверно укорачивала ОДП после одной, трех и десяти сессий (р < 0,02) Межгрупповой анализ изменения данного показателя после однократного воздействия ИМП четких различий в опытных группах не выявил, в то время как троекратное воздействие было более эффективным для сокращения времени припадка в режимах с частотами 1 Гц (40, 20 и 10% от ММИ) и 0,5 Гц (20 и 10% от ММИ) (р < 0,05). Анализ динамики общей длительности припадка указывает на избирательность эффекта для рТМС частотой 1 Гц интенсивностью 20% от ММИ с проведением 10 процедур, поскольку данный режим стимуляции отличался от показателей остальных опытных подгрупп более значимым укорочением ОДП (р < 0,05). Заключение Таким образом, рТМС способна изменять структуру и продолжительность фаз эпилептического припадка в тесте МЭШ. Возникновение статистически значимого по сравнению с контрольной группой отсутствия МТЭЗК при увеличении числа процедур в различных частотных диапазонах имеет специфические паттерны. В отношении изменения структуры первично-генерализованных судорог в тесте МЭШ наиболее эффективным является режим магнитной стимуляции частотой 1 Гц и интенсивностью 20% от ММИ, поскольку он оказывает влияние на все фазы припадка, что позволяет говорить об избирательном накопительном эффекте в отношении отсутствия МТЭЗк, отсутствия тонических и клонических судорог. Наличие значительного количества режимов, которые приводят к достоверной редукции тонической фазы судорог после однократного воздействия по сравнению с десятикратным, свидетельствует об активации ранних механизмов нейропластичности и накопительном эффекте воздействия рТМС. ИМП способно редуцировать длительность тонических судорог в тесте МЭШ, причем линейный характер данного явления наблюдается в двух режимах: 1 Гц (20% от ММИ) и 0,1 Гц (10% от ММИ). Режим рТМС частотой 1 Гц (20% от ММИ) обеспечивает уменьшение длительности фазы клонических судорог и общей продолжительности припадка. ТМС вызывает универсальную реакцию для всех значений частот и интенсивностей ИМП в отно шении редукции длительности феномена «педалирования» вне зависимости от числа процедур, что свидетельствует о чувствительности механизмов генерации клонических судорог с утратой рефлекса переворачивания ко всем параметрам ИМП и об универсальном действии рТМС на данную фазу припадка в тесте МЭШ. Таким образом, полученные результаты экспериментальных данных обосновывают применение ТМС в клинической практике для коррекции пароксизмальной активности у пациентов, страдающих эпилепсией.

Об авторах

Ольга Васильевна Кистень

Белорусская медицинская академия последипломного образования

Email: kisten@tut.by
БелМАПО, каф. неврологии и нейрохирургии, докторант, канд. мед. наук

Владимир Сергеевич Улащик

Институт физиологии НАН Беларуси

НИИ физиологии, глав. науч. сотр., д-р мед.наук, проф., акад. НАН Беларуси

Виктор Владимирович Евстигнеев

Белорусская медицинская академия последипломного образования

Email: w.evst@tut.by
БелМАПО, каф. неврологии и нейрохирургии, проф., д-р мед. наук

Список литературы

Дополнительные файлы