Повышение эффективности и безопасности редактирования гена CCR5 человека путем выбора оптимальных направляющих РНК нуклеаз SpCas9 и AsCas12A

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Достижения в области редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas открыли новые возможности для лечения многих заболеваний человека, включая ВИЧ-инфекцию. Нокаут гена CCR5, как потенциальный способ лечения ВИЧ-инфекции, изучается уже давно. Проанализированы ранее изученные направляющие (гидовые) РНК нуклеаз SpCas9 и AsCas12a, нацеленные на ген CCR5, и отобраны наиболее эффективные из них. С использованием биоинформатических подходов проведен поиск новых гидовых РНК этих же нуклеаз. Сравнили эффективность расщепления целевых сайтов нуклеазами SpCas9, SpCas9-HF1-plus и AsCas12a в комплексе с выбранными гидовыми РНК, а также их нецелевую активность. Показано, что две из протестированных гидовых РНК для SpCas9-HF1-plus и три для AsCas12a обеспечили разрезание гена CCR5 в 60–72% клеток, при этом их нецелевая активность находилось ниже предела детекции. Таким образом, эти гидовые РНК можно рассматривать в качестве кандидатов для разработки подходов генной терапии ВИЧ-инфекции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Р. Р. Минтаев

Центр стратегического планирования и управления медицинскими и биологическими рисками, Федеральное медико-биологическое агентство

Автор, ответственный за переписку.
Email: ramil.mintaev@fbb.msu.ru
Россия, Москва

Д. В. Глазкова

Центр стратегического планирования и управления медицинскими и биологическими рисками, Федеральное медико-биологическое агентство

Email: ramil.mintaev@fbb.msu.ru
Россия, Москва

Ю. А. Таран

Центр стратегического планирования и управления медицинскими и биологическими рисками, Федеральное медико-биологическое агентство

Email: ramil.mintaev@fbb.msu.ru
Россия, Москва

Е. В. Богословская

Центр стратегического планирования и управления медицинскими и биологическими рисками, Федеральное медико-биологическое агентство

Email: ramil.mintaev@fbb.msu.ru
Россия, Москва

Г. А. Шипулин

Центр стратегического планирования и управления медицинскими и биологическими рисками, Федеральное медико-биологическое агентство

Email: ramil.mintaev@fbb.msu.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Cornu T.I., Mussolino C., Müller M.C., Wehr C., Kern W.V., Cathomen T. (2021) HIV gene therapy: an update. Hum. Gene Ther. 32, 52–65.
  2. Allers K., Hütter G., Hofmann J., Loddenkemper C., Rieger K., Thiel E., Schneider T. (2011) Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Δ32/Δ32 stem cell transplantation. Blood. 117(10), 2791–2799.
  3. Hütter G., Nowak D., Mossner M., Ganepola S., Müssig A., Allers K., Schneider T., Hofmann J., Kücherer C., Blau O., Blau I.W., Hofmann W.K., Thiel E. (2009) Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N. Engl. J. Med. 360(7), 692–698.
  4. Peterhoff D. (2023) New case of HIV cure: joined forces of haploidentical stem cells and HLA-mismatched cord blood. Signal Transduct. Target. Ther. 8(1), 241.
  5. Doudna J.A., Charpentier E. (2014) Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR/Cas9. Science. 346, 1258096.
  6. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819–823.
  7. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S. (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. 31, 230–232.
  8. Kang H., Minder P., Park M.A., Mesquitta W.T., Torbett B.E., Slukvin I.I. (2015) CCR5 disruption in induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9 provides selective resistance of immune cells to CCR5-tropic HIV-1 virus. Mol. Ther. Nucl. Acids. 4, e268.
  9. Nerys-Junior A., Braga-Dias L.P., Pezzuto P., Cotta-de-Almeida V., Tanuri A. (2018) Comparison of the editing patterns and editing efficiencies of TALEN and CRISPR/Cas9 when targeting the human CCR5 gene. Genet. Mol. Biol. 41, 167–179.
  10. Cradick T.J., Fine E.J., Antico C.J., Bao G. (2013) CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucl. Acids Res. 41, 9584–9592.
  11. Fine E.J., Appleton C.M., White D.E., Brown M.T., Deshmukh H., Kemp M.L., Bao G. (2015) Trans-spliced Cas9 allows cleavage of HBB and CCR5 genes in human cells using compact expression cassettes. Sci. Rep. 5, 10777.
  12. Dabrowska M., Czubak K., Juzwa W., Krzyzosiak W.J., Olejniczak M., Kozlowski P. (2018) qEva-CRISPR: a method for quantitative evaluation of CRISPR/Cas-mediated genome editing in target and off-target sites. Nucl. Acids Res. 46, e101.
  13. Yu S., Yao Y., Xiao H., Li J., Liu Q., Yang Y., Adah D., Lu J., Zhao S., Qin L., Chen X. (2018) Simultaneous knockout of CXCR4 and CCR5 genes in CD4+ T сells via CRISPR/Cas9 confers resistance to both X4- and R5-tropic human immunodeficiency virus type 1 infection. Hum. Gene Ther. 29, 51–67.
  14. Liu X., Wang M., Qin Y., Shi X., Cong P., Chen Y., He Z. (2018) Targeted integration in human cells through single crossover mediated by ZFN or CRISPR/Cas9. BMC Biotechnol. 18, 66.
  15. Xu L., Yang H., Gao Y., Chen Z., Xie L., Liu Y., Liu Y., Wang X., Li H., Lai W., He Y., Yao A., Ma L., Shao Y., Zhang B., Wang C., Chen H., Deng H. (2017) CRISPR/Cas9-mediated CCR5 ablation in human hematopoietic stem/progenitor cells confers HIV-1 resistance in vivo. Mol. Ther. 25, 1782–1789.
  16. Xu L., Wang J., Liu Y., Xie L., Su B., Mou D., Wang L., Liu T., Wang X., Zhang B., Zhao L., Hu L., Ning H., Zhang Y., Deng K., Liu L., Lu X., Zhang T., Xu J., Li C., Wu H., Deng H., Chen H. (2019) CRISPR-edited stem cells in a patient with HIV and acute lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 381(12), 1240–1247.
  17. Li C., Guan X., Du T., Jin W., Wu B., Liu Y., Wang P., Hu B., Griffin G.E., Shattock R.J., Hu Q. (2015) Inhibition of HIV-1 infection of primary CD4+ T-cells by gene editing of CCR5 using adenovirus-delivered CRISPR/Cas9. J. Gen. Virol. 96, 2381–2393.
  18. Mandal P.K., Ferreira L.M., Collins R., Meissner T.B., Boutwell C.L., Friesen M., Vrbanac V., Garrison B.S., Stortchevoi A., Bryder D., Musunuru K., Brand H., Tager A.M., Allen T.M., Talkowski M.E., Rossi D.J., Cowan C.A. (2014) Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15, 643–652.
  19. Ehrke-Schulz E., Schiwon M., Leitner T., Dávid S., Bergmann T., Liu J., Ehrhardt A. (2017) CRISPR/Cas9 delivery with one single adenoviral vector devoid of all viral genes. Sci. Rep. 7, 17113.
  20. Hosseini Rouzbahani N., Kaviani S., Vasei M., Soleimani M., Azadmanesh K., Nicknam M.H. (2019) Generation of CCR5-ablated human induced pluripotent stem cells as a therapeutic approach for immune-mediated diseases. Iran. J. Allergy Asthma Immunol. 18, 310–319.
  21. Vakulskas C.A., Dever D.P., Rettig G.R., Turk R., Jacobi A.M., Collingwood M.A., Bode N.M., McNeill M.S., Yan S., Camarena J., Lee C.M., Park S.H., Wiebking V., Bak R.O., Gomez-Ospina N., Pavel-Dinu M., Sun W., Bao G., Porteus M.H., Behlke M.A. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nat. Med. 24, 1216–1224.
  22. Gomez-Ospina N., Scharenberg S.G., Mostrel N., Bak R.O., Mantri S., Quadros R.M., Gurumurthy C.B., Lee C., Bao G., Suarez C.J., Khan S., Sawamoto K., Tomatsu S., Raj N., Attardi L.D., Aurelian L., Porteus M.H. (2019) Human genome-edited hematopoietic stem cells phenotypically correct mucopolysaccharidosis type I. Nat. Commun. 10, 4045.
  23. Scharenberg S.G., Poletto E., Lucot K.L., Colella P., Sheikali A., Montine T.J., Porteus M.H., Gomez-Ospina N. (2020) Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nat. Commun. 11, 3327.
  24. Liu Z., Chen S., Jin X., Wang Q., Yang K., Li C., Xiao Q., Hou P., Liu S., Wu S., Hou W., Xiong Y., Kong C., Zhao X., Wu L., Li C., Sun G., Guo D. (2017) Genome editing of the HIV co-receptors CCR5 and CXCR4 by CRISPR/Cas9 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection. Cell Biosci. 7, 47.
  25. Ye L., Wang J., Beyer A.I., Teque F., Cradick T.J., Qi Z., Chang J.C., Bao G., Muench M.O., Yu J., Levy J.A., Kan Y.W. (2014) Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, 9591–9596.
  26. Li X., Bai Y., Cheng X., Kalds P.G.T., Sun B., Wu Y., Lv H., Xu K., Zhang Z. (2018) Efficient SSA-mediated precise genome editing using CRISPR/Cas9. FEBS J. 285, 3362–3375.
  27. Kang X., He W., Huang Y., Yu Q., Chen Y., Gao X., Sun X., Fan Y. (2016) Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J. Assist. Reprod. Genet. 33, 581–588.
  28. Qi C., Li D., Jiang X., Jia X., Lu L., Wang Y., Sun J., Shao Y., Wei M. (2018) Inducing CCR5Δ32/Δ32 homozygotes in the human jurkat CD4+ cell line and primary CD4+ cells by CRISPR/Cas9 genome-editing technology. Mol. Ther. Nucl. Acids. 12, 267–274.
  29. Wang W., Ye C., Liu J., Zhang D., Kimata J.T., Zhou P. (2014) CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9, e115987.
  30. Scott T., Urak R., Soemardy C., Morris K.V. (2019) Improved Cas9 activity by specific modifications of the tracrRNA. Sci. Rep. 9, 16104.
  31. Cho S.W., Kim S., Kim Y., Kweon J., Kim H.S., Bae S., Kim J.S. (2014) Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, 132–141.
  32. Gao Z., Herrera-Carrillo E., Berkhout B. (2018) Improvement of the CRISPR-Cpf1 system with ribozyme-processed crRNA. RNA Biol. 15, 1458–1467.
  33. Liu Z., Liang J., Chen S., Wang K., Liu X., Liu B., Xia Y., Guo M., Zhang X., Sun G., Tian G. (2020) Genome editing of CCR5 by AsCas12a renders CD4+ T cells resistance to HIV-1 infection. Cell Biosci. 10, 85.
  34. Ratti V., Nanda S., Eszterhas S.K., Howell A.L., Wallace D.I. (2020) A mathematical model of HIV dynamics treated with a population of gene-edited haematopoietic progenitor cells exhibiting threshold phenomenon. Math. Med. Biol. 37, 212–242.
  35. Casini A., Olivieri M., Petris G., Montagna C., Reginato G., Maule G., Lorenzin F., Prandi D., Romanel A., Demichelis F., Inga A., Cereseto A. (2018) A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nat. Biotechnol. 36, 265–271.
  36. Lee J.K., Jeong E., Lee J., Jung M., Shin E., Kim Y.H., Lee K., Jung I., Kim D., Kim S., Kim J.S. (2018) Directed evolution of CRISPR/Cas9 to increase its specificity. Nat. Commun. 9, 3048.
  37. Tycko J., Myer V.E., Hsu P.D. (2016) Methods for optimizing CRISPR/Cas9 genome editing specificity. Mol. Cell. 63, 355–370.
  38. Kulcsár P.I., Tálas A., Tóth E., Nyeste A., Ligeti Z., Welker Z., Welker E. (2020) Blackjack mutations improve the on-target activities of increased fidelity variants of SpCas9 with 5’G-extended sgRNAs. Nat. Commun. 11, 1223.
  39. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Zheng Z., Joung J.K. (2016) High-fidelity CRISPR/Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529, 490–495.
  40. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR/Cas system. Cell. 163, 759–771.
  41. Labun K., Montague T.G., Krause M., Torres Cleuren Y.N., Tjeldnes H., Valen E. (2019) CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucl. Acids Res. 47, W171–W174.
  42. Глазкова Д.В., Ветчинова А.С., Богословская Е.В., Жогина Ю.А., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. (2013) Подавление экспрессии гена CCR5-рецептора человека с помощью искусственных микроРНК. Молекуляр. биология. 47, 475–485.
  43. GitHub/lioj/bioinformatics/offTargetPipeline at master. Доступен онлайн: https://github.com/lioj/bioinformatics/tree/master/offTargetPipeline (Проверено 07.05.2024).
  44. Doench J.G., Fusi N., Sullender M., Hegde M., Vaimberg E.W., Donovan K.F., Smith I., Tothova Z., Wilen C., Orchard R., Virgin H.W., Listgarten J., Root D.E. (2016) Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR/Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184–191.
  45. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827–832.
  46. Labuhn M., Adams F.F., Ng M., Knoess S., Schambach A., Charpentier E.M., Schwarzer A., Mateo J.L., Klusmann J.H., Heckl D. (2018) Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR/Cas9 applications. Nucl. Acids Res. 46, 1375–1385.
  47. Suzuki K., Tsunekawa Y., Hernandez-Benitez R., Wu J., Zhu J., Kim E.J., Hatanaka F., Yamamoto M., Araoka T., Li Z., Kurita M., Hishida T., Li M., Aizawa E., Guo S., Chen S., Goebl A., Soligalla R.D., Qu J., Jiang T., Fu X., Jafari M., Esteban C.R., Berggren W.T., Lajara J., Nuñez-Delicado E., Guillen P., Campistol J.M., Matsuzaki F., Liu G.H., Magistretti P., Zhang K., Callaway E.M., Zhang K., Belmonte J.C.I. (2016) In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540, 144–149.
  48. Concordet J.P., Haeussler M. (2018) CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucl. Acids Res. 46(W1), W242–W245.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Эффективность гРНК. Приведены средние значения, полученные в трех независимых экспериментах и стандартные отклонения. Пунктирная линия показывает пороговое значение, использованное для выбора гРНК, нецелевую активность которых определяли в последующих экспериментах.

Скачать (163KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Частота мутаций в 63 прогнозируемых нецелевых участках SpCas9 (a) и SpCas9-HF1-plus (б). Данные получены в двух независимых экспериментах. *p-value < 0.001 по точному критерию Фишера по сравнению с контролем.

Скачать (308KB)
Метаданные
4. Дополнительные материалы
Скачать (449KB)
Метаданные
5. Таблица S5
Скачать (59KB)
Метаданные
6. Таблица S6
Скачать (26KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025